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实验一动物细胞融合13生物基地201300140059刘洋2015-03-08同组者：吕赞一、实验目的1.了解动物细胞融合的常用方法。2.学习化学融合和电融合的基本操作。3.观察动物细胞融合过程中的行为和变化。二、实验原理1.病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可以介导病毒同宿主细胞融合，也可以介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。2.化学诱导融合很多化学试剂都能诱导细胞融合，如聚乙二醇（PEG），二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂，磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复的过程中相接处的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG是被广泛使用的化学融合剂。3.电击诱导融合包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制，融合概率高，作用机制明确，可重复性高等优点。三、实验材料和用品1.材料鸡血红细胞。2.试剂50%PEG、0.85%氯化钠溶液、GKN缓冲溶液。3.器材倒置显微镜、离心机、量筒、血细胞计数器、载玻片、盖玻片、离心管等。四、实验步骤1.取鸡血2ml加入2mlAlsever液，再加6mlAlsever液，混匀后制悬液（可4℃保存）。2.取（1）制备的悬液1ml加入4ml0.85%NaCl，进行以下三次离心处理（用于清洗细胞表面，0.85%NaCl为鸟类生理盐水）（1）1200r/min离心5min，去上清液，再加入0.85%NaCl至5ml。（2）1000r/min离心5min，去上清液，再加入0.85%NaCl至5ml。（3）1000~1200r/min离心7min，去上清液。3.将上步最后一次的沉降血球（去上清液后约为0.1~0.2ml），加入GKN液至1~2ml，使之成为10%细胞悬液。4.取（3）制备的10%血球悬液1ml，加入3mlGKN液，使每ml含红血球1.5×107个/ml5.分别取（4）1ml加入0.5ml50%PEG液，取（4）0.5ml加入0.5ml50%PEG液，取（4）0.5ml加入1ml50%PEG液，根据PEG浓度静置30s左右，混匀并滴片，在常温下静置2~3min，镜检。五、实验结果细胞融合的三种状态特写三种浓度的宏观图六、讨论与结论本次实验观察到了典型的细胞融合现象，可以说是比较成功，但是也有两点缺憾：1.由于混匀时用滴管吹打次数较少，使得红血球分散不够均匀，发生结块现象，对观察产生了明显的干扰作用。2.由于PEG和细胞悬液没有完全充分地混匀，导致细胞融合成功率降低，视野中能观察到的融合细胞较少。3.制片时在载玻片上滴加悬液过多，使得观察时细胞有明显地分层与流动现象，干扰观察。七、附录细胞融合技术的应用1.单克隆抗体动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。细胞膜开始融合细胞质开始融合细胞核开始融合1.0ml+0.5mlPEG0.5ml+0.5mlPEG0.5ml+1.0mlPEG被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在细胞杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，可用于探讨①蛋白质的精细结构；②淋巴细胞亚群的表面新抗原；③组织相容性抗原；④激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；⑤肿瘤的定位和分类；⑥纯化微生物和寄生虫抗原；⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法(“导弹”疗法,利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合，将药物带至病灶部位。因此，单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。2.细胞疗法将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合，融合子进行有丝分裂形成囊胚，囊胚的内细胞团是多能干细胞，对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植，不仅解决了器官和组织来源问题，而且也避免宿主对外来物的免疫排斥。3.用于基因定位和绘制人类基因图谱杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。4.植物细胞融合育种植物细胞融合可分为体细胞杂交和配子-体细胞杂交，前者是指不经过有性生殖，而直接由体细胞原生质体融合产生杂种细胞，形成愈伤组织，并再生出植株的过程，后者是指性细胞原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞，形成愈伤组织，并再生出植株的过程。植物细胞融合是植物细胞工程的一个重要分支，是一种突破物种生殖隔离、创造远缘杂交的新途径。自1960年Cocking用酶解法分离出番茄根原生质体后，Nataga和Takebe1970年首次利用烟草叶分离出原生质体，经培养获得再生植株；1975年以色列的Vardi等首次从木本植物shamonti甜橙珠心组织诱导胚愈伤组织，并从愈伤组织分离原生质体，经培养通过胚状体再生出植株；在禾本科植物中，除灾珍珠谷、紫狼尾草用悬浮细胞为材料，较早获得原生质体再生植株外，直到1985年Fujimura等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株，才出现了重大突破。现在已从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂交细胞系或杂种植物。随着多种细胞原生质体的成功培养和融合技术的不断改进，植物细胞融合获得了巨大成功。目前已经成功得到的融合植株有甘蓝-青菜、大豆-马塘草、矮牵牛-龙面花、大麦-花生、大麦-大豆、小麦-矮牵牛、油菜-大豆、玉米-大豆、大豆-野豌豆、大麦-蚕豆、大豆-香草木樨、大豆-烟草和大豆-秋水仙等。5.微生物原生质体融合构成新菌株微生物原生质体的获得、纯化、培养等类似于植物原生质体。微生物原生质体融合是一种方法简便用途较广的技术，在育种中将会有更多的实际应用。