细胞生物学荧光技术原理和应用

《细胞生物学荧光技术原理和应用》读书报告一、书名：细胞生物学荧光技术原理和应用二、著者：刘爱平主编三、出版社：中国科学技术大学出版社2007-2-1第一版四、页数：320五、内容大意：随着生命科学研究的快速发展，生物荧光技术在细胞免疫学、微生物学、分子生物学、分子遗传学、神经分子生物学、病理学、肿瘤学、临床检验学、医学、植物学等方面的应用越来越广泛；制备各种荧光生物样品的方法越来越多；用于荧光检测的仪器种类不断增加，而且也越来越先进。荧光技术已经成为生命科学研究的重要手段之一。本书共分三部分：第一部分介绍荧光的基本知识、发展史、荧光探针、活体荧光材料——绿色荧光蛋白(GFP)及最新型荧光材料——量子点；第二部分介绍荧光技术在生命科学中的应用及荧光生物样品的制备方法；第三部分介绍了中国科学技术大学生命科学学院现已拥有的生物荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、细胞遗传工作站、活细胞荧光工作站、流式细胞仪、荧光定量PCR仪等荧光检测仪器的基本原理、操作步骤及注意事项。书中彩页的大部分照片是使用中国科学技术大学生命科学学院拥有的上述各种荧光检测仪器获得的。六、读后心得：本书编写目的是为了给对细胞生物学荧光技术感兴趣的老师、研究生和本科生提供基本知识、相关的实验方法和技术参考。我的专业是有机化学，研究的专业方向是复合份菁染料及其在光动力疗法中的应用，其中要用到很多细胞生物学荧光技术方面的知识。因而在本书的阅读过程中也是有选择性的重点阅读与自己专业相关的部分,即前两部分，因为第三部分涉及到具体的仪器操作，与平时实验研究距离很远，不略去不读。我们实验室研究内容之一—菁染料，它属于荧光色素，是能够产生荧光并能作为染料的化合物。这类有机化合物有着这样的分子结构特征：分子中具有刚性结构和平面结构的π-π共轭体系。有机化合物分子中具有的π电子共轭结构者，其荧光效率随着π电子共轭程度的增加而增大，所发生的荧光光谱也将向长波长方向移动。任何有利于提高π电子共轭程度的结构改变，都能提高荧光效率或使荧光波长长移。菁染料是一类具有特殊结构的功能性化合物，其分子内部含有n个次甲基－CH＝（称为甲川基）组成的共轭链（n可为奇数或偶数），共轭链与其两端或中间连的杂环、芳环、环烯化合物等形成了一个大的π共轭体系。它具有摩尔吸光系数高、光谱响应范围广以及荧光量子产率高等特性。基于这些性质特点，菁染料在核酸测定、蛋白质分析、作为活细胞染色剂、肿瘤检测及癌细胞识别、作为生物大分子的标记物及光动力疗法中有广泛的应用。对于第一部分中，本人比较感兴趣的是第四章—常用的荧光染料（探针），细胞器荧光探针和研究钙调节及活性的荧光探针。细胞器的荧光探针是一类能够渗透到细胞内，并能选择性地与细胞中的细胞器结合的荧光物质，其实质就是荧光染料。细胞器的荧光探针不但可用于固定细胞中的细胞器染色，而且还可以用于活细胞中的细胞器染色。荧光染料可以选择性地与线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体结合，再利用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜观察，可得到这些细胞器的高分辨率的清晰图像，这对于研究细胞形态有很大的帮助。菁染料也可以用于活细胞染色中，染料可以透过细胞膜进入细胞中，将线粒体染色，而且发现对线粒体染色具有特异性。钙离子作为细胞内的第二信使具有重要的生物学功能，而钙离子的信使功能是通过细胞内游离钙离子浓度及其分布的变化来实现的，钙离子信号的产生和终止是细胞内钙离子增减及波动的结果。因此细胞内钙离子含量及其分布变化的动态监测对于钙离子信号传递本质的认识至关重要。第二信号系统是当前研究的焦点，本书中介绍了以下几种荧光探针可供这方面的研究：钙调蛋白荧光探针、蛋白激酶C的荧光探针、钙离子的荧光探针。目前，细胞内游离钙离子的研究主要采用荧光探针标记，通过荧光显微成像分析来实现，钙离子荧光探针的设计合成是在对钙离子高度专一的钙离子螯合剂的母体上连接适当的荧光发色团和靶向定位基团，通过改变钙离子螫合剂具有的配位功能团或与之相连接的荧光发色团和靶向定位基团结构，即可获得具有不同分析性能的钙离子荧光探针。螯合剂部分主要决定探针与钙离子结合的亲和力和选择性；而荧光发色团部分除了作为螯合剂分子上的取代基对探针与钙离子结合的亲和力和选择性有影响外，还主要决定试剂的光谱性能。而菁染料作为荧光探针与现有的其它荧光标记试剂如罗丹明、荧光素等相比更具优越性，其原因总结起来主要有以下几点：第一,菁染料类型众多,广泛分布在波长350nm到几乎1200nm的区域中,具有很大的可比性及选择性。它们与生物分子键合后的活性衍生物能用于同时测试多种物质,多色或多参数分析对于简化操作,降低成本极为有利,且可提高在一个复杂的混合体系中不同被标示成分的测定速率；第二,大多数菁染料及其衍生物的荧光较强；第三,这类染料具有相对的光稳定性,不会在荧光显微镜下迅速猝灭；第四,这类染料可作为简单有效的偶合试剂；第五,染料类型多样,通过结构的改变可使试剂具有不同的水溶性,而且所带电荷也可改变。这样就不会干扰分子与被测物的键合,并减少不必要的连接；第六,这类染料的分子量相对较小(约1000),这样就不会对被标记分子的连接与功能产生位阻效应。过去的20年中,对于恶性肿瘤的化学疗法的研究取得了很大进展,已研制出多种抗癌药物,并经临床应用.但在固体肿瘤组织的治疗中,传统方法收效甚微.癌症仍然是导致人类死亡的主要因素之一。目前现有的化疗抗癌药物有两大缺陷,即副作用及抗药性。传统抗癌药物的副作用在于它们对于正常的组织细胞也会不加区别的杀死。为克服目前癌症化疗的缺点,抗癌药物要有新的作用机理。众所周知,癌症一般都是在癌细胞的数量很多时才能被发现。如果能够在早期刚刚出现几个癌细胞时就可以检测出,自然有利于治疗。能够从正常细胞中辨识出癌细胞并有选择地杀死癌细胞,是现阶段科学工作者研究的主要目标。光动力疗法(PDT,PhotodynamicTherapy)的基本原理是:用对光有特殊敏感作用的物质标识癌细胞,然后再用强光或激光照射,使癌细胞或癌组织上的标记物发生光化学反应,造成癌细胞的毒性以杀灭癌细胞。由于这些特殊性能的光标识材料在正常细胞中很容易代谢、排除,而在肿瘤细胞上却能停留相当长的时间,由此,在一定时间之后正常细胞组织上的标记物已消失,只有在癌细胞组织上保留着这些标记物。所以光动力疗法只造成肿瘤组织的坏死,而不伤害周围的正常细胞组织。光动力疗法是除手术、化疗和放射疗法之外的第4种治疗肿瘤的方法.它副作用小,不会引起外表损伤。由于PDT具有高度的选择性,能破坏肿瘤组织而不伤害正常组织,是一种很有价值的治疗方法,因而已得到广泛的注意。光动力学疗法的优点不同于传统的手术、放疗和化疗三大治疗肿瘤手段，它对靶组织及损伤程度都具有可选择性，可减少对正常组织的损伤。与手术、化疗、放疗等常规治疗手段相比，光动力学疗法有如下重要优点：（1）创伤很小：借助光纤、内窥镜和其他介入技术，可将激光引导到体内深部进行治疗，避免了开胸、开腹等手术造成的创伤和痛苦。（2）毒性低微：进入组织的光敏药物，只有达到一定浓度并受到足量光照射，才会引发光动力学反应而杀伤肿瘤细胞，是一种局部治疗的方法。人体未受到光照射的部分，并不产生这种反应，人体其他部位的器官和组织都不受损伤，也不影响造血功能，因此光动力疗法的毒副作用是很低微的。光动力作用后，不同的细胞原发损伤可通过多种途径诱发细胞内钙信号产生，而后钙信号又通过多种病理过程引起肿瘤细胞凋亡。钙信号介导肿瘤细胞凋亡的病理损害作用主要有：促使细胞能量耗竭；增加自由基生成；损伤细胞功能；介导或促进DNA损伤。光动力作用可通过损伤线粒体、内质网、细胞膜、溶酶体、细胞骨架诱导细胞内产生钙信号，从而诱导肿瘤细胞凋亡。因为线粒体在产生能量和维持Ca2+动态平衡中发挥着重要作用，是与细胞死亡关系最为密切的亚细胞结构之一。内质网是细胞内钙储备和钙信号转导的主要部位，当前研究认为细胞内的钙稳态主要是通过内质网来实现的。许多光敏剂与细胞温育后定位于内质网，部分光敏剂经过合成后转运最终定位于内质网，因此内质网是光动力作用的一个非常重要的损伤靶点。细胞质膜是光敏剂最先接触的部位，是亲脂性光敏剂的首选位点，而亲水性光敏剂也优先聚集于此，细胞质膜成分因此成为光动力损伤的重要靶点。广泛的细胞质膜损伤主要引起细胞坏死，原发损伤则通过激活相关信号途径诱导细胞凋亡。溶酶体是细胞内由一层单位膜包围的膜性细胞器，内含各种酸性水解酶，能分解各种内源和外源性的物质。定位于溶酶体的光敏剂在光照射后通过溶酶体酶释放到细胞质引起细胞凋亡。和其他几种光敏剂相比，细胞凋亡的过程非常缓慢。真核细胞的空间结构由细胞骨架维持，微管、微丝以及中间丝这三种类型的细胞骨架在结构上相互连接，彼此协同发挥作用。近年对细胞凋亡信号转导的研究发现：三种细胞骨架在细胞凋亡过程中变化非常活跃：其调节细胞内钙离子浓度的作用已受到广泛关注。有研究显示：细胞骨架是某些光敏剂介导的光动力损伤的重要靶点。然而目前，光动力疗法对肿瘤细胞的杀伤效率还不理想。治疗后还会发现残存的肿瘤细胞，其可能原因之一是：细胞内Ca2+浓度的升高激活了细胞内的多种酶系统，既能诱导细胞凋亡，也能同时激活细胞内的保护机制，导致一些肿瘤细胞可能在光动力损伤后得到及时修复，从而影响了光动力疗法的损伤效果，但目前对钙信号所激活的细胞自身保护机制了解不多。相信，随着对光动力疗法中钙信号转导机制的深入研究和阐明，将来可以通过抑制Ca2+激活的细胞保护机制来提高PDT的杀伤效率，使光动力疗法在肿瘤治疗中发挥更大作用。在PDT疗法中,不同结构的菁染料因其性质不同,故作用也不同。某些菁染料如份菁及氧代菁因其自身对某类细胞具有辨识性,能选择性地进入标示癌细胞或作为光毒剂杀死癌细胞,可直接作为光敏剂用PDT中,或作为辐射敏化剂用于固体肿瘤的治疗中。而大多数染料不具备对特定器官及组织的选择性.因此,这类染料必须与生物活性载体如蛋白质、肽、脂类相连结,才可能使染料进入身体内的特定区域。21世纪是生命科学的世纪，揭开生命现象的神秘面纱,探寻不治之症的秘药良方,已成为科学研究的重点。随着生物技术的快速发展,荧光分析技术在基因测序、表达,蛋白质测序及临床诊断等方面的应用将占有重要地位,而性能优良的荧光探针的开发则是发展这一技术的决定性因素。对于菁染料的研究及应用尽管已有100多年的历史,但由于其自身结构的优越性而历久弥新。为设计和开发性能良好的荧光探针,应着重研究染料的性能与分子结构的关系,以便研究开发出具有优良性能的菁染料用于生物医学领域。