搜索
细菌基因组DNA的提纯与纯化姓名学号同组人班级实验时间摘要：不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同。目前，有许多商品化的核酸分离柱，可简单、快速地分离到高纯度的DNA。本次实验选用黄色粘球菌DK1622，使用试剂盒BacterialDNAisolationkit(Omega)进行细菌基因组DNA的提纯与纯化，旨在学习并掌握细菌基因组DNA提取的原理和方法。通过本次实验，我们达到了实验预期，取得了良好的实验效果。关键词：黄色粘球菌DK1622、基因组DNA、试剂盒法1.引言生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。真核细胞的DNA主要存在于细胞核中，与蛋白质相结合构成大小不一的染色体。而原核生物的DNA不与任何蛋白质相结合。基因组DNA的提取一般包括：①破碎细胞；②去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子；③沉淀核酸；④去除盐类、有机溶剂等杂质；⑤纯化干燥；⑥溶解等几个主要步骤。破碎细胞是为了释放DNA，其方法因样本不同而不同，可用反夏冻融、SDS和NaOH处理、蛋白酶和溶菌酶酶解以及超声波破碎等方法。蛋白质对DNA制品的污染常常影响到后续的DNA操作过程，因此，在DNA提取过程中必须把蛋白质除去。一般去除蛋白质常用酚／氯仿抽提法。酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响，经酚／氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相。这种方法对于去除DNA中大量的蛋白质杂质是行之有效的，因此也是DNA纯化中的基本方法。少量的或与DNA紧密结合的蛋白质杂质则可用蛋白酶予以去除。DNA制品中也会有RNA杂质，但RNA极易降解。况且，少量的RNA对DNA操作无大影响，必要时可加入不含DNase的RNase以去除RNA的污染。为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是利用冷乙醇和盐沉淀核酸，通过离心将核酸回收。用70%～80%乙醇洗涤沉淀，可除去沉淀中多余的盐，以避免其对核酸溶解的影响以及对后续步骤的酶促反应的抑制作用。在进行基因组的大量提取时，利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器的小分子DNA或质粒DNA分离。由于基因组DNA一般都很长，对剪切力十分敏感，提取时容易发生机械断裂，产生大小不同的片段。因此，在基因组DNA提取过程中，为保证得到较长的DNA，应尽量避免以下因素导致的DNA降解：（1）物理降解。在实际操作时应尽可能轻缓，尽量避免过多的溶液转移和剧烈的振荡等，以减少机械张力对DNA的损伤，同时也应避免过高的温度。此外，操作所用的吸头口不能太小，应剪去尖端部分，使其孔径变大。（2）细胞内源DNase的作用。细胞内常存在活性很高的DNase，细胞破碎后，DNase便可与DNA接触并使之降解。为了避免DNase的作用，在溶液中常加入EDTA、SDS以及蛋白酶等。EDTA具有螯合Ca2+和Mg2+的作用，而Ca2+和Mg2+是DNase的辅助因子。SDS和蛋白酶则分别具有使蛋白质变性和降解的作用。（3）化学因素也会降解DNA。例如，过酸的条件下，由于DNA存在腺嘌呤而导致DNA的不稳定，极易在碱基脱落的地方发生断裂。因此，在DNA提取过程中，应避免采用过酸条件。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同。目前，也有许多商品化的核酸分离柱，可简单、快速地分离到高纯度的DNA。电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如EB染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。溴化乙锭（EB）是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小（或数量）成正比。核酸在溶液中由于磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面六个因素：（1）样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与分子量（所含碱基）的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。（2）DNA分子的构象：分子量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA（cccDNA）的一条链断裂，变成开环DNA（ocDNA）分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA（LinerDNA）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型（cccDNA）迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状（ocDNA）分子。（3）琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度愈低，则凝胶孔径愈大，DNA电泳迁移速度越快，即分子量越大，选用的凝胶浓度应越小。（4）电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比。电压愈高带电颗粒泳动愈快，但随着电场强度增加，高分子量DNA的泳动速率以不同幅度增加，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减小，为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V/cm。（5）电泳缓冲液:在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。电泳缓冲液的作用：①维持合适的pH。电泳时，正极发生氧化反应（4OH-+4e-→2H2O+O2），负极发生还原反应（4H++4e-→2H2），长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的pH保持基本不变；②使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01～0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化；③电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1～2mM，目的是螯合Mg2+等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。电泳缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率，当电泳液为无离子水（如不慎在凝胶中忘记加缓冲液，即误用蒸馏水配置凝胶），溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下（如错用10×电泳缓冲液），导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。（6）温度：DNA在琼脂糖凝胶电泳中的行为受碱基组成和凝胶温度影响不明显。不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在4～30℃内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0.5％时凝胶很脆弱，最好在4℃下电泳以增加凝胶强度。2.材料和方法2.1材料和试剂实验菌株：黄色粘球菌DK1622实验试剂：试剂盒BacterialDNAisolationkit(Omega)、TE溶液、BTLbuffer、proteinaseK溶液、RNaseA、BDLbuffer、无水乙醇、bufferHB、washbuffer、ElutionBuffer、琼脂糖、灭菌双蒸水ddH2O、1×TAE缓冲液、溴化乙锭（EB）溶液、6×上样缓冲液（6/10×loadingbuffer）实验仪器：离心机、水浴锅、涡旋振荡器、微量移液器、不同类型的枪头、1.5mLEp管2.2方法2.2.1试剂盒法提取细菌基因组DNA（1）将黄色粘球菌培养液倒入1.5mLEp管中，在离心机中10,000rpm离心2min，弃上清。（2）重复收集一次，即继续向刚才的1.5mLEp管中倒入黄色粘球菌培养液，重复以上步骤，使1.5mLEp管中共收集3.0mL培养液中的菌体。（3）向菌体沉淀中加入500μLTE，充分涡旋重悬。（4）将菌液在离心机中10,000rpm离心2min，尽可能吸弃上清。（5）向菌体沉淀中加入200μLBTLbuffer，涡旋重悬。（6）向菌液中加入25μLproteinaseK溶液，涡旋混匀；（7）将菌液55℃水浴45min，期间每15～20min振荡混匀一次。（8）向菌液中加入5μLRNaseA，颠倒混匀。（9）将菌液放置在水浴锅中37℃水浴30min。（10）将菌液在离心机中12,000rpm离心5min。（11）小心转移上清到一新的Ep管中。（12）加入220μLBDLbuffer，颠倒混匀。（13）65℃水浴10min。（14）加入220μL无水乙醇，充分涡旋，确保没有任何沉淀。（15）将DNA纯化柱（蓝色）组装到2mL收集管上。（16）将上述样品全部、小心转移到柱子中。（17）12,000rpm离心1min，弃流出液。（18）将柱子组装到第二个收集管上，加入500μLbufferHB。（19）12,000rpm离心1min，弃流出液。（20）将柱子组装到同一个收集管上，加入700μLwashbuffer。（21）12,000rpm离心1min，弃流出液。（22）重复洗涤一次，即再加入700μLwashbuffer，12,000rpm离心1min，弃流出液。（23）使用同一收集管，13,000rpm离心2min。（24）将柱子安装到新的Ep管上，加入50μL65℃预热的ElutionBuffer，室温静置5min。（25）12,000rpm离心1min，收集DNA。（26）重复收集一次。2.2.2琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA（1）0.8%琼脂糖凝胶的制备。①正确组装制胶槽、制胶板、样品梳。②取40mL1×TAE至250mL干净红盖瓶中，称量0.3g琼脂糖，混匀，轻旋瓶盖，微波炉加热沸腾3-4次，至溶液澄清无颗粒。③待溶液冷却至60℃左右，加入20μL1mg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，使EB溶液终浓度为0.5μg/mL，混匀后缓缓倒入架好样品梳的制胶槽中，冷却凝固待用（冷却凝固时间要在30min以上）。之后轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳槽中事先加入1×TAE电泳缓冲液），即可上样。（2）电泳上样。①取1.0μL纯化DNA、4μL双蒸水、1μL上样缓冲液（6/10×loadingbuffer），用微量移液器吹吸混匀。②将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1×TAE至高出胶面约1mm。③将上述混合好的DNA样品，按照表1顺序，点样到凝胶中。（3）凝胶电泳与DNA分离。①开启电泳仪电源。②选择合适的电压（120V）和时间（40min）。③将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极，与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极，与电泳仪负极相连。④启动电泳，待观察到负极有气泡升起方可离开。⑤电泳结束，关闭电源，取出凝胶。⑥紫外灯下观察电泳结果，摄片，保存，分析。表1DNA样品加样顺序泳道1234567样品λDNAλ/HindⅢ1组DNA样品2组DNA样品3组DNA样品4组DNA样品5组DNA样品样量5μL5μL6μL6μL6μL6μL6μL泳道891011121314样品DL20006组DNA样品7组DNA样品8组DNA样品9组DNA样品10组DNA样品λ/HindⅢ样量5μL6μL6μL6μL6μL6μL5μL3.结果1234567891011121314bp9,416（1）λDNA、λ/HindⅢ、DL2000的作用是marker。这些marker都是线形DNA。细菌基因组DNA在细菌体内呈环形，经实验提取后呈线形。提取得到的细菌基因组DNA应该越完整越好。（2）本实验选用的琼脂糖凝胶浓度为0.8%，DNA片段有效分离范围大约是0.2～20kb，D