实例图解简并引物设计

实例图解简并引物设计一、序言设计一对合适的引物是PCR扩增目的基因成功的关键，但许多人往往过度依赖PrimerPremier（以下简称PP）或Oligo等引物设计软件，有时候引物没设计成，却身陷软件之中无法自拔。其实，不论特异性引物或简并引物，只要掌握了几个关键点，手动也可以设计出一对好引物。如果不是大批量设计引物或设计复杂的引物序列，下面的四个常用工具即可轻松胜任引物设计任务。下文以马铃薯Y病毒CP基因简并引物设计为示例，分享一些个人经验，希望对初学者能起个抛砖引玉作用。受专业领域及水平所限，文中有不当之处，敬请各位同仁、同学批评指正。二、相关工具1.MEGA5-多重序列比对、选取基因区域、序列编辑；2.DNAMAN8-检测两引物的互补性；3.OligoCalc-评估引物的属性；4.WebLogo3-直观显示简并碱基。三、基本原则设计一对好的引物，归结起来就是5′端引物、3′端引物之间以及两者与模板的关系处理得恰到好处：1.两引物的序列要与模板的序列紧密互补；2.两引物不能在模板的非目的位点发生错配；3.两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。四、延伸原则1.引物长度：常用为18-27bp，最大不可超过38bp，否则容易导致延伸温度过高，不适合DNA聚合酶反应；2.GC含量：一般介于40%-60%之间，且两个引物之间的GC含量相差不能过于悬殊；3.碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的GC，GC富集区容易导致错误引发反应。五、特别注意5′端引物的作用主要限定PCR产物的长度，对扩增特异性影响不大；引物的延伸是从3′端开始的，所以3′端引物是影响特异性扩增的最关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3′端引物时，需要综合考虑以下几个内容：1.不要终止于密码子的第3位；2.末位碱基避免使用碱基A；3.避免出现3个以上连续的G或C，如GCG或CCC或GGG；4.ΔG的绝对值不可超过9；5.与非特异扩增的序列同源性不能超过70%或有连续8个互补碱基源；6.不能进行任何修饰。六、设计流程七、示例背景马铃薯Y病毒（PotatovirusY，PVY）是侵染马铃薯、烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR技术具有高度的特异性和灵敏性等特点，已经成为PVY检测最常见的方法。但由于PVY株系分化严重，不断有新的重组株系产生，单一的特异性引物无法适应PVY不同株系的检测需求，需要设计一对简并引物以能够满足生产上的检测需求。八、详细图解1.序列准备：•（1）GenBank下载PVY全基因组序列；•（2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用MAFFT多重序列比对；•（3）扩增片段区域选择，CP基因长度及位置如下图所示：先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角Site处直接输入CP基因上游分界点位置（8391）后回车。接着点击“Speicaes/Abbrv”和8391那一列的交界点时按下键盘上“Shift”不放，移动光标到“1”那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删除冗余序列。裁切后得到CP基因编码区序列，“ExportAlignment”导出CP基因序列（推荐fasta格式）。2.引物设计推荐先设计3′端引物，至于原因，上面的【特别注意】中已提到，这里不再赘述。（1）选择引物序列综合考虑引物设计原则及特别注意，在CP基因3'端位置选取一段合适的序列（784-803bp），804bp位置为A且是第三个密码子位置，所以弃去末位的A碱基。PS：是否位于密码子的第3位，可以通过“TranlatedProteinSequences”-“DNAsequences”切换查看，如右图，CP基因的末端3个碱基是终止密码子所在的位置，A是第三位密码子。（2）生成SeqLogo选定序列后，参考上述步骤，删除冗余序列，保留CP基因3‘端序列，同样导出为Fasta文件，将序列粘贴入WebLogo3的文本框内或直接上传序列文件，设置相关参数后点击“Create”生成SeqLogo格式的文件CP-3.fas。参数设置：“Outputformat”（输出格式）推荐用“PDF”，“Colorscheme”（颜色方案）推荐用“Classic(NA)”，设置完毕，点击右下角“CreateLogo“即可得下图的SeqLogo格式文件。通过WebLogo生成的多重比对图片可以很直观得到3'端序列为CTTGGAGT(C/T/G)AA(G/A)AACATGTG，查询简并碱基代码表（下图），可知C/T/G=B，G/A=R，简并度=3×2=6，整理后3′端序列为CTTGGAGTBAARAACATGTG，故而需要合成的3′端引物序列：CACATGTTYTTVACTCCAAG（与原序列是反向互补关系）。简并碱基代码代码碱基代码碱基RA,GYC,TKG,TSG,CMA,CWA,TBG,C,TVA,G,CDA,G,THA,C,TNA,G,C,T3.质量评估•（1）参数评估将初步得到的引物序列，粘贴入OligoCalc的文本框内，按下“Calculate”按钮，得到引物的相关参数，如：长度、GC含量、Tm值等信息。•（2）自身互补性（CheckSelf-Complementarity）点击“CheckSelf-Complementarity”，检测引物自身互补性，主要查看“Potentialhairpinformation”、“3’Complementarity”、“Allpotentialself-annealingsitesaremarkedinred(allowing1mis-match)”下方显示内容，如果三项均为“none”，则说明引物自身不会形成发夹结构且引物自身不会互补，引物没问题！（3）BLAST比对回检点击“Blast”可以对引物进行BLAST比对检测，结果显示，都是PVYCP基因相关的序列，表明所设计的引物特异性良好。（4）两引物互补性检查•同样方式，得到5'端序列：GSAAAYGAYACAATYGATGC，根据引物设计原则，需要检测两引物之间是否存在序列互补。•打开DNAMAN，依次在“Primer”-“Loadprimer”，粘贴任意一端引物序列，如：5'端序列-GSAAAYGAYACAATYGATGC，确定。接着，在“Primer”-“TwoprimersComplementarity”-“SecondPrimerFromInput”，粘贴入另一端序列，这里为3'端引物序列：CACATGTTYTTVACTCCAAG，如下图：结果显示，两引物间仅有3个碱基互补，且自由能仅为1.8Kcal/mol。（5）实验验证PCR扩增采用的50μL反应体系为：10×TransTaqHiFiBufferII5μL，2.5nMdNTPs4μL，5′端引物（10μmol/L）2μL，3′端引物（10μmol/L）2μL，ddH2O34.75μL，TransTaqHiFiPolymerase（5U/μL）0.25μL，cDNA2μL。PCR扩增程序条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后一轮循环后72℃延伸10min。反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，如下图所示：M.DNA分子量标准（100bp）；泳道1-5：PVY的不同株系（C、O、N、NTN、N-Wi）；泳道6-7：阴性对照（健康马铃薯）和空白对照；泳道8-12：PVX、PVM、PVA、PVS、PLRV九、延伸阅读•[1]吴祖建,高芳銮,沈建国.生物信息学分析实践.科学出版社,2010:30-60.•[2]高芳銮,沈建国,史凤阳,方治国,谢联辉,詹家绥.我国马铃薯Y病毒的检测及CP基因的分子变异.中国农业科学,2013,46:3125-3133.•[3]史凤阳,高芳銮,常飞,詹家绥.马铃薯Y病毒简并引物的开发与检测应用.2013年中国马铃薯大会会议论文,2013,pp:289.