结核分枝杆菌.

2019/12/17结核分枝杆菌1结核分枝杆菌2019/12/17结核分枝杆菌2选题？2019/12/17结核分枝杆菌31.结核的现状结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WHO统计，全球约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年有约200万人死于结核。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核感染导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的2倍以上，曾经一度控制良好，再次死灰复燃，随着耐药菌株的出现和传播，结核控制更加棘手。2019/12/17结核分枝杆菌42.患者的需要•有患者咨询，结核病怎么检查2019/12/17结核分枝杆菌53.医生的需求•有医生咨询结核病的检查2019/12/17结核分枝杆菌64.各类考试常见的考点•中级职称•高级职称•研究生考试2019/12/17结核分枝杆菌7分枝杆菌属Mycobacterium•一类直或微弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，可呈丝状或菌丝样生长。细胞壁脂质含量高（分枝菌酸），耐酸，抗酸染色阳性。对氧和营养要求高，生长慢。又称抗酸杆菌(acid-fastbacillus)---不易着色，可抵抗盐酸酒精的脱色作用•分类属放线菌科，本属有80多种，可分三类：结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌。细菌的DNAG+Cmol%为62－702019/12/17结核分枝杆菌8结核分枝杆菌一、分类结核分枝杆菌（MycobacteriumTuberculosis，TB）复合群：人结核分枝杆菌(M.tuberculosis)牛分枝杆菌(M.bovis)非洲分枝杆菌田鼠分枝杆菌2019/12/17结核分枝杆菌9二、细菌特性•形态染色TB菌细长略弯曲，有时可见分枝，呈单、成堆或成束排列，无鞭毛、无芽胞，有荚膜。可出现多形性，在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。TB菌革兰染色阳性。荧光染料金胺O染色，在荧光下菌体呈橘黄色。萋～尼氏抗酸性染色法染色，菌体染成红色。2019/12/17结核分枝杆菌10•培养特性专性需氧菌，3%－5%的CO2能促进生长。最适ph6.5～6.8，最适温度为37℃，低于30℃难生长，营养要求高，在含有蛋黄、马钤薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能生长，且生长缓慢。固体培养基---典型菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、乳酪色或淡黄色，形似菜花样。液体培养基---生长较快呈粗糙皱纹状菌膜生长，有毒株可呈索状生长（吐温干扰）。2019/12/17结核分枝杆菌11•生化反应生化不活泼。不发酵糖类，多数菌株触酶阳性，热触酶阴性，非结核分枝杆菌正好相反。结核分枝杆菌烟酸和硝酸盐试验阳性，耐噻吩－2－羧酸肼(T2H)，牛型则相反。有毒株中性红试验阳性。•变异性TB菌易发生形态、菌落、最适生长温度、毒力和耐药性的变异。如卡介苗、Much颗粒和多重耐药菌株出现等。2019/12/17结核分枝杆菌12•抵抗力TB菌细胞壁含大量脂类，抵抗力较强干痰中存活6-8个月，粘附尘埃上保持传染性8-10天，阴湿处能生存5个月以上。3%HCL或4%NaOH、6%H2SO4溶液中能耐受30分钟紫外线、酒精的抵抗力弱。(如在水中煮沸1分钟，阳光曝晒2～3小时，75%酒精内数分钟即死亡。)最简单的方法是直接焚烧带有病菌的痰纸。2019/12/17结核分枝杆菌13•致病物质（未发现产生内毒素、外毒素、侵袭性酶）1.脂质－脂质占菌体干重的20～40%，占胞壁干重的60%。①磷脂：能刺激单核细胞增生，并可抑制蛋白酶的分解作用，使病灶形成干酷样坏死。②索状因子：是分枝菌酸与海藻糖的复合物，具有破坏细胞线粒体膜，毒害微粒体酶类，抑制中性粒细胞游走和吞噬作用，引起慢性肉牙肿。具有该物质的TB菌毒株，在液体培养基中能紧密粘成索状。③蜡质D：是一种肽糖脂与分枝菌酸复合物，能引起迟发型变态反应，并具有佐剂作用。④硫酸脑苷脂：TB菌毒株胞壁中含有，能抑制吞噬细胞中的吞噬体与溶酶体融合，使结核杆菌在细胞内存活。2019/12/17结核分枝杆菌14•致病物质2.荚膜－主要为多糖，少量脂质和蛋白质。①粘附和入侵②分解物质提供营养③防止有害物质入侵3.蛋白质－TB菌菌体内都含有数种蛋白质，其中重要的蛋白质是结核菌素。结核茵素与蜡质D结合，能引起较强的迟发型变态反应。其他蛋白质可引起机体产生相应的抗体，但无保护作用。2019/12/17结核分枝杆菌15三、临床意义TB菌引起结核病。对人类致病的有人结核分枝杆菌、牛型结核杆菌和非洲分枝杆菌，人型结核杆菌感染引起的发病率最高。成为全球性重大公共卫生问题。•所致疾病TB菌的致病作用可能是细菌在细胞内增殖引起炎症反应，以及诱导机体产生免疫反应性损伤，属于IV型（迟发型）变态反应。通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官，其中以肺结核最常见。可分原发感染和继发感染。•免疫性TB菌的感染率很高，发病率却较低，这表明人体感染结核杆菌可获得一定的抗结核免疫力，这种免疫称为有菌免疫或传染性免疫。TB菌的免疫原rRNA和变应原结核菌素诱发机体产生由T淋巴细胞介导细胞免疫反应。2019/12/17结核分枝杆菌16导致的疾病•1.肺结核，飞沫传播为最常见方式•原发性肺结核•血行播散型肺结核•浸润型肺结核•慢性纤维空洞型肺结核•结核性胸膜炎2019/12/17结核分枝杆菌17肺结核实验室诊断•结核菌检查：•痰中找到结核菌是确诊肺结核的主要依据。•直接厚涂片阳性率优于薄涂片•无痰或儿童不会咳嗽，可采用清晨的胃洗液找结核菌，成人亦可通过纤支镜刷片或涮洗液查找结核菌•PCR法，40个结核菌即可出现阳性结果2019/12/17结核分枝杆菌18•2.肠结核•患者多有开放性肺结核或喉结核，经常吞咽含结核杆菌的痰液而患病。，主要位于回盲部。•辅助诊断：•结核菌素试验•X线胃肠钡餐造影或钡剂灌肠•结肠镜，活检找到干酪样坏死性肉芽肿或结核杆菌具有确诊意义。•大便找抗酸杆菌？•大便结核杆菌PCR？2019/12/17结核分枝杆菌19•3.泌尿生殖系统结核---尿液•4.结核性脑膜炎---脑脊液•5.结核性腹膜炎---腹水•6.关节结核---关节液2019/12/17结核分枝杆菌20四、微生物学检验临床标本涂片检查分离培养核酸检测抗体检测直接涂片集菌涂片处理标本或无污染标本染色液体培养基固体培养基动物试验（罗氏或米氏）抗酸..金胺O..37℃，涂片镜检仪器培养＜7天生长＞7天生长快速生长菌慢生长菌菌种鉴定抗酸染色菌落特点鉴定试验药敏试验2019/12/17结核分枝杆菌21•标本采集感染部位不同，取不同的标本常见标本：痰、纤支镜刷片、尿、胸腹水、脑脊液、关节液等•检查方法1.显微镜检查1）直接涂片：用萋－尼氏法染色，若镜检找到抗酸性杆菌，通常应报告：“找到抗酸性杆菌”，需进一步分离培养鉴定。2）浓缩集菌涂片：如标本中菌量少，杂菌和杂质多时，用离心沉淀法将菌浓缩聚集，再取沉淀物涂片作抗酸染色检查荧光染料金胺O染色，在荧光下菌体呈橘黄色。萋～尼氏抗酸性染色法染色，菌体染成红色。2019/12/17结核分枝杆菌222019/12/17结核分枝杆菌232019/12/17结核分枝杆菌242019/12/17结核分枝杆菌252019/12/17结核分枝杆菌262019/12/17结核分枝杆菌27菜花样菌落2019/12/17结核分枝杆菌28•2、分离培养TB菌接种前处理－液化和处理杂菌4%NaOH、6%H2SO4、胰酶15-20min培养基选择—罗氏培养基鉴别培养基(PNB、T2H、NAP)仪器培养—Bacte460、BacT/ALERT3D液体培养基培养时间—长一般6-8周•鉴定1.染色性2.菌落特征3.生长速度4.色素产生5.生化试验2019/12/17结核分枝杆菌29•鉴别试验：NAP(p-nitro-α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenome)抑制试验结核分枝杆菌NAP-非结核分枝杆菌NAP+2019/12/17结核分枝杆菌30•药物敏感试验•动物接种菌株分离和检测毒力2019/12/17结核分枝杆菌31•3、结核菌素试验：OT或PPD迟发型超敏反应结核菌素的纯蛋白衍化物（PPD）皮内注射0.1ml（5IU）硬结≥5mm为阳性反应，如无反应，可在一周后再用5IU，如仍为阴性，大致可除外结核感染，但也要考虑感染的窗口期，还未建立充分的变态反应，应用糖皮质激素等免疫抑制药物、免疫力低下或营养不良也成阴性反应。结核菌素试验对婴幼儿的诊断价值较成人大，3岁以下强阳性反应者，应视为有新近感染的活动性肺结核。2019/12/17结核分枝杆菌324、抗体检测检测PPDIgG辅助诊断。目前血清抗阿拉伯糖甘露糖脂IgG抗体是一种新的较好的诊断结核病的指标。5、抗原检测6、核酸检测快速诊断：PCR-特异性核酸探针7、高效液相色谱分析技术测分枝菌酸可鉴定菌种8、全血干扰素测定2019/12/17结核分枝杆菌332019/12/17结核分枝杆菌34基于T淋巴细胞检测结核感染的原理•结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，结核感染后体内长期存在抗原特异性的记忆性T细胞•当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增殖，释放r干扰素•r干扰素是结核分枝杆菌感染后机体免疫应答中最重要的细胞因子2019/12/17结核分枝杆菌35由来----γ干扰素释放试验（IGRAs）IFN-γ在调节对结核分支杆菌的细胞介导的免疫反应中起重要作用，从而使得（interferongammareleaseassays）IGRAs用于检测结核感染。IGRAs通过检测代表结核分支杆菌的抗原刺激T淋巴细胞反应后释放IFN-γ的量来判断是否存在结核杆菌感染。2001年—QFTQuantiFERON-TB2005年—QFT-G2007年—QFT-GIT2008年—T-Spot-TB2019/12/17结核分枝杆菌36T-SPOT-TB—定义以结核特异的混合抗原A和混合抗原B（分别为ESAT-6和CFP-10的部分多肽片断）刺激结核杆菌感染者外周血单核细胞中存在结核特异的活化T淋巴细胞分泌γ干扰素，从而应用ELISPOT方法检测对结核杆菌反应的效应T细胞数量，对结核杆菌感染进行辅助诊断。特异抗原ELISPOT活化的T细胞2019/12/17结核分枝杆菌37T-SPOT-TB—几个概念•ELISPOT（enzyme-linkedimmunospotassay,）是一种新型的免疫酶技术，它是从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞。（简单说：可以数出分泌特异因子的细胞的个数）•ESAT-6和CFP-10蛋白：存在结核分枝杆菌及少数致病非结核分枝杆菌中名为“RD1”的基因序列，编码产生两种蛋白。在卡介苗菌株和大部分环境中的分枝杆菌基因中则缺乏次序列。2019/12/17结核分枝杆菌38基于T淋巴细胞检测结核感染的原理T-SPOT.TB技术：•利用结核杆菌感染者外周血单个核细胞（PBMC）中存在结核特异性T细胞，这些淋巴细胞在受到结核特异抗原刺激后分泌r干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。•检测外周血中受结核特异抗原刺激释放r干扰素的T淋巴细胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表一个细胞，计算计算对结核杆菌反应的效应T细胞数量2019/12/17结核分枝杆菌39基于T淋巴细胞检测结核感染的原理包2019/12/17结核分枝杆菌40基于T淋巴细胞检测结核感染的原理2019/12/17结核分枝杆菌41基于T淋巴细胞检测结核感染的原理2019/12/17结核分枝杆菌42基于T淋巴细胞检测结核感染的原理•空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点数大于20时视为试验有效•T-SPOT.TB试验结果用每106PBMCs中斑点形成细胞（SFCs）的数目来描述，即SFCs/106PBMCs2019/12/17结核分枝杆菌43T-SPOT.TB的临床意义•T-SPOT.TB高灵敏度2019/12/17结核分枝杆菌44T-SPOT-TB—解释•非黄金标准•敏感性95.3%-98.8%•特异性94.