结核分枝杆菌Hsp163与感染巨噬细胞凋亡的相关性研究

1（加急）稿号：2012-159，收稿日期：2012-4-9结核分枝杆菌Hsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的相关性研究*姚楠，董江涛，徐芳，田玺泽，吴芳，章乐，吴江东，张万江**（石河子大学医学院病理生理学教研室，石河子大学《新疆地方与民族高发病》教育部重点实验室，新疆石河子832002）【摘要】目的建立结核分枝杆菌感染RAW264.7株巨噬细胞模型，研究结核分枝杆菌Hsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的相关性。方法分别用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株感染RAW264.7巨噬细胞株，于感染后1、3、6及12h，利用激光共聚焦显微镜鉴定卡介苗及结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株感染RAW264.7巨噬细胞模型；同时利用流式细胞技术于上述各时间点检测各组感染巨噬细胞的凋亡率，并分析其时相性变化；利用PCR技术扩增模型目的基因，利用Western-blot检测上述各个时间点Hsp16.3蛋白表达水平的时相性变化。结果成功构建了结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型。巨噬细胞感染结核分枝杆菌后凋亡率升高，其中感染后1h和12h凋亡率H37Rv感染组与BCG感染组比较差异有统计学意义（P0.05）；巨噬细胞感染结核分枝杆菌后的PCR产物大小为435bp；感染细胞Hsp16.3蛋白表达升高，其中感染后1h和3h升高更显著。结论结核分枝杆菌感染可导致巨噬细胞凋亡，感染巨噬细胞的凋亡率与菌株毒力强弱相关，弱毒力结核分枝杆菌感染的巨噬细胞早期凋亡更显著；结核分枝杆菌感染巨噬细胞的凋亡与结核分枝杆菌表达Hsp16.3水平高低相关，在感染早期强毒力结核分枝杆菌Hsp16.3表达水平较高。【关键词】结核分枝杆菌H37Rv株；BCG；Hsp16.3；巨噬细胞；凋亡CorrelationStudybetweenHsp16.3ofmycobacteriumtuberculosisandtheapoptosisofinfectedmacrophagesYAONan,DONGJiang-tao,XUFang,TIANXi-ze,WUFang,ZHANGLe,ZHANGWan-jiang(DepartmentofPathophysiology,MedicalSchool,LaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDiseases,ShiheziUniversity,Shihezi832002,Xinjiang,China)【Abstract】ObjectiveToestablishthemodelsofmycobacteriumtuberculosisinfectingRAW264.7macrophages,andstudythecorrelationbetweenHsp16.3ofmycobacteriumtuberculosisandtheapoptosisofinfectedmacrophages.MethodsRAW264.7cellswereinfectedbyH37RvandBCGstrains,afterbeinginfectedof1h,3h,6h,and12h,theinfectedRAW264.7macrophagesmodelswereidentifiedbyConfocallasterscanningmicroscope.Thenflowcytometrywasusedtodetectthemacrophageapoptosisrateandanalysisinfectedmacrophagesgroupapoptosisrate’schangeindifferenttimephases.AfterPCRamplifyingmodelpurposegene,westernblotwasusedtocompareandanalysistheHsp16.3levelsofphasechanges.ResultsEstablishedthemodelsofmycobacteriumtuberculosisinfectingmacrophages.AfterbeinginfectedbyH37RvandBCG,theapoptosisrateofmacrophagesincreased.Theapoptosisratein1hand12hincreasedobviously,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P0.05).Withmacrophagesbeinginfectedbymycobacteriumtuberculosis,therewasspecificbandsat435bpofPCRamplificationproducts;TheexpressionofMTBHsp16.3increasedafterinfection,whichincreasedobviouslyin1hand3h.ConclusionTheinfectionofMtbinducedthemacrophages’apoptosis;theapoptosisratewasrelatedtothevirulenceofmycobacteriumtuberculosis;macrophageswhichwereinfectedbytheweakvirulentmycobacteriumtuberculosishadamuchmorepronounedearlyapoptosis.Beinginfectedbydifferentvirulenceofmycobacteriumtuberculosis,theapoptosisrateofmacrophageswasrelatedtotheexpressionlevelsofMTBHsp16.3ofwhichtheexpressionofthepowerfullvirulentmycobacteriumtuberculosiswasmuchmoresignificantthanthatofthelessvirulentintheearlyphaseofinfection.【Keywords】H37Rv;BCG;Hsp16.3;macrophage;apoptosis2*【基金项目】国家自然科学基金项目(No.30960355)；石河子大学科学技术研究发展计划“自然科学与计划创新”重点项目（No.ZRKX2010ZD01）。**【通讯作者】张万江，E-mail:[e-mail]【作者简介】姚楠（1983-），女，安徽太和人，硕士研究生，从事感染性疾病的发病机制与防治研究。E-mail:[e-mail]据世界卫生组织估算，全球有近l/3的人感染结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,Mtb），其中10%发展为活动性结核病，大多数转变为潜伏感染[1]。而巨噬细胞吞噬入侵的MTB是机体抗结核免疫力的第一步。巨噬细胞的凋亡能限制MTB的生长，甚至杀灭巨噬细胞内的MTB，在结核病的防御中起着至关重要的作用。MTB小分子热休克蛋白Hsp16.3是MTB在进入宿主巨噬细胞等情况下大量诱导表达合成的一种蛋白，对MTB在宿主巨噬细胞内长期生长、繁殖和致病扮演着重要作用。本研究主要观察MTB国际标准强毒株H37Rv菌株（H37Rv)和卡介苗菌株（BCG)体外诱导巨噬细胞凋亡时相性变化，初步探讨MTBHsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的相关性。材料与方法1材料1.1细菌MTBH37Rv株和BCG菌株由中国药物生物制品检定所提供。培养18d后分别取罗氏培养基上生长良好的H37Rv菌株和BCG菌株于磨菌器中，加少量含0.05%Tween-80的生理盐水研磨均匀，用不含抗生素的DMEM培养液(含10%胎牛血清)稀释成菌悬液，调整细菌浓度为1.0×10个7/ml。1.2细胞RAW264.7细胞株由本实验室提供。用完全DMEM培养液培养RAW264.7细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化并收获细胞，通过台盼兰染色做活细胞测定，活细胞比率大于95%。显微镜下计数，调整细胞浓度为1.0×106个/ml。2方法2.1MTB感染巨噬细胞模型的建立取6孔细胞培养板，每孔加2ml细胞悬液，置37℃5%CO2细胞培养箱中孵育24h；移去培养液，用预温的不含血清的DMEM培养液洗涤细胞培养板2次，去除非贴壁细胞；每孔加2ml细菌（H37Rv或BCG）悬液，使细菌与巨噬细胞的比例为10︰1[2]。培养板置37℃5%CO2培养箱中孵育。细菌感染4h后，用预温的无血清DMEM培养液洗涤细胞培养板2次，以去除细胞间未被巨噬细胞吞噬的细菌。细胞培养板每孔加完全DMEM培养液(含终浓度为100U/ml的青、链霉素和10%胎牛血清)2ml继续培养，并以此时作为细胞感染的0时，分别于感染后的1、3、6和12h结束培养。2.2实验分组及检测感染巨噬细胞凋亡时间的选择细胞模型随机分为H37Rv组和BCG组，分别于感染后1、3、6和12h收集细胞，检测细胞凋亡率。2.3利用激光共聚焦显微镜技术鉴定复制模型①按照模型复制的方法将模型种植在6孔板内处理好的盖玻片上；②分别在感染RAW264.7巨噬细胞后的1、3、6、12h结束培养，取出盖玻片，PBS液浸洗，室温下用4%多聚甲醛静置固定15min，蒸馏水冲洗3次；③取30%H2O21份与纯甲醇50份混匀，室温下浸泡盖玻片30min，蒸馏水冲洗3次；④滴加山羊血清封闭液，置室温20min，甩去多余液体，不冲洗；⑤滴加1︰1000稀释的一抗，使其均匀铺在盖玻片，置4℃冰箱过夜，PBS液冲洗3次，每次3min以去除多余的抗体；⑥滴加荧光素标记二抗，置室温2h,用PBS冲洗，激光共聚焦显微镜下观察结果，RAW264.7巨噬细胞内有绿色荧光表明模型3复制成功。步骤③～⑥均在湿盒中进行。2.4巨噬细胞凋亡率检测培养结束后，取出细胞培养板，离心，去除上清液，加入500μl1×BindingBuffer重悬细胞，细胞悬液移至测量管中，每管加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI（Annexin+V-FITC/PI检测试剂盒购自美国BioVision公司），检测前每管再加入1.5mlPBS，然后用流式细胞仪检测。以AnnexinV+/PI-判断为早期凋亡，以AnnexinV+/PI+判断为晚期凋亡，两种凋亡率之和为总凋亡率。2.5MTBhsp16.3基因的扩增2.5.1H37Rv、BCG株因组DNA的提取收集感染模型，加入50ul25%蔗糖和50ul1×TE，混匀；加入125mg/ml溶菌酶80ul、10%SDS500ul、20mg/ml蛋白酶K20ul，混匀，置37℃水浴5h，以3000r/min（离心半径xxcm）离心10min，留取上清，加入等体积氛︰氯仿，以12000r/min离心10min，再用预冷无水乙醇沉淀，沉淀溶于50ulTE中,置于-20℃保存备用。2.5.2Hsp16.3基因扩增以H37Rv株DNA为模板，参照GenBank发表的MTBHsp16.3基因序列设计1对引物。上游引物：5′-CGCGGATCCATGGCCACCACCCTTC-3′；下游引物：5′-CCCAAGCTTTCAGTTGGTGGACCGG-3′。以上引物由上海生工生物工程公司合成。PCR反应体系：10×buffer5μl，dNTPs1μl，DNA模板2μl，P1、P2引物及Taq酶各0.5μl，ddH2O40.5ul。PCR反应条件：94℃变性3min；94℃45s，62℃45s，72℃50s，共30个循环；最后72℃延伸5min。2.5.3PCR产物的鉴定制备2%琼脂糖凝胶。取5μlPCR产物，加入1μl上样缓冲液，混匀后加样于凝胶载样孔中，以110V电泳30min，在凝胶成像仪QuantityOne成像系统下观察结果并照相。2.5.4目的基因测序将筛选出的目的片段进行单向测序，由北京华大基因科技