结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒研发步骤

结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒研发步骤非竞争性内标法1.模板的获得（TB标品和内标DNA）(1)普通PCR反应选用一种工作标准品为模板，根据巨细胞病毒荧光定量检测试剂盒说明书进行普通PCR反应，反应后溶液进行琼脂糖凝胶电泳，并对目的条带进行切胶回收。(2)连接由于Taq酶的PCR反应产物末端带A，故直接以上述切胶回收的PCR片段为目的PCR片段，按pGMT克隆试剂盒进行10μl连接体系的配制，4℃过夜连接。(3)转化10μl昨日过夜连接的体系转入50μlTP10感受态细胞中，冰浴30min，42℃90s热激，冰浴2-3min，加入600μlLB培养基后37℃震荡培养90min。分别涂100μl于现倒的蓝白筛选平板，37℃过夜培养。(4)检测挑取白色菌落接种于1-5mlLB培养基中，摇到一定浓度后，以菌液为模板用普通PCR进行验证。(5)测序选择条带正确的菌液进行测序。2.基因的查找和比对（TB标品和内标DNA）从网点的genbank中下载所需要的序列，与测序结果进行比对。由于不知道测序基因的具体名称，故需要进行大量的比对以找出其在genebank中的序列。TB标品DNA序列：CACATCAGCCGCGTCCACGCCGCCAACTACGGTGTTTACGGTGCCCGCAAAGTGTGGCTAACCCTGAACCGTGAGGGCATCGAGGTGGCCAGATGCACCGTCGAACGGCTGATGACCAAACTCGGCCTGTCCGGGACCACCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCATB内标DNA序列：CACATCAGCCGCGTCCACATCTGATCCGTAGCGACTACGGACGCGCGCCTACGCCCTTCTCAGTTAA3.引物和探针的设计（TB标品和内标DNA）(1)引物设计引物序列：上游引物TB-F：5’CACATCAGCCGCGTCCACG3’19bp下游引物TB-R：5’TGGTCCTGCGGGCTTTGC3’18bp内标引物：上游引物TBN-F：5’ACATCAGCCGCGTCCAC3’17bp下游引物TBN-R：5’AACTGAGAAGGGCGTAGGC3’19bp(2)Taqman探针设计TB标品DNA探针（第一通道）：5’端荧光报告集团FAM3’端荧光淬灭基团TAMRATB标品探针FAM-AGGTGGCCAGATGCACCGTCGAACG-TAMRATM=74TB内标DNA探针（第二通道）：5’端荧光报告集团HEX3’端荧光淬灭基团BHQ1TB内标探针HEX-CTGATCCGTAGCGACTACGGACGCG-BHQ1TM=734.实时荧光定量PCR实验体系的优化(1)引物退火温度引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。所有oligo软件会自动计算引物的Tm值。在设置退火温度时可以如下进行：以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度，进行温度梯度PCR，找到引物的最佳退火温度。找到引物的最佳退火温度：58.8℃(2)引物浓度引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。将引物的终浓度分别设置为几个梯度，使用RT-PCR进行扩增，从扩增曲线质量上选取最佳的引物浓度。(3)探针浓度由于反复冻融易导致探针降解，在确认探针质量好的情况下，最好稀释成2μM（10×），作为工作浓度分装多支，避光保存。将探针的终浓度设置为200nM左右的几个梯度，使用RT-PCR进行扩增，从扩增曲线质量上及电泳图谱选取最佳的引物浓度。如果荧光信号强度不足，可以增加至0.4uM。(4)镁离子浓度镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μMdNTP的实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液（普通PCR是1.5mM）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，普通PCR从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。(6)dNTPs浓度将探针的终浓度设置为0.2mM左右的几个梯度，使用RT-PCR进行扩增，从扩增曲线质量及电泳图谱上选取最佳的dNTPs浓度。(7)模板浓度对模板做一个梯度稀释的实验。此外，每个引物都要设无模板对照，阳性对照以及污染对照。最佳反应体系及配比（50μl）：稀释105的TB标品DNA：1μl稀释105倍的TB内标DNA：0.25μlTB-F（10μM）：0.5μlTB-R（10μM）：0.5μlTBN-F（10μM）：0.5μlTBN-R（10μM）：0.5μlTB标品-Probe（10μM）：1μlTB内标-Probe（10μM）：1μldNTPs（2.5mM）：0.8μlMgCl2（25mM）：0.3μl10*Buffer（天根HotMaster）：5μl天根HotMasterTaqPolymerase：0.4μlddH2O：39.5μl反应程序：95℃5min；95℃20s，60℃1min，40Cycles5.试剂盒检测所需条件的测定(1)特异性实验对不同的质粒和cDNA样品进行RT-PCR反应，每个样品3个重复，观察该试剂盒的特异性。(2)灵敏度实验对模板进行10倍倍比稀释，应用建立的荧光定量PCR进行反应，每个稀释倍数3个重复，观察该试剂盒的敏感性。(3)重复性实验应用建立的荧光定量PCR方法对模板进行重复检测。(4)稳定性实验将荧光定量PCR反应体系混匀后分装冷冻保存，定期取出检测。