维生素E的含量检验方法

维生素E的含量检验方法一、目的：建立维生素E含量标准检验方法，保证分析结果的准确性。二、依据：GB/T5009.82-2003三、范围：本规程适用于本公司维生素E含量检验操作四、职责：质量检验员对本标准的实施负责五、正文：1、试制和溶液1.1无水乙醚：:不含有过氧化物。1.1.1过氧化物检查方法:用5mL乙醚加1mL10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉溶液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。1.1.2去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放人纯铁丝或铁末少许。弃去10%初馏液和10%残馏液。1.2无水乙醇：不得含有醛类物质1.2.1检查方法：取2mL银氨溶液于试管中，加人少量乙醇，摇匀，再加人氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。1.2.2脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾人1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天(不时摇动，促进反应)，经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50mL。当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加。1.3无水硫酸钠。1.4甲醇：重蒸后使用。1.5重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。1.6抗坏血酸溶液(100g/L)：临用前配制。1.7氢氧化钾溶液(1+1),1.8氢氧化钠溶液(100g/1)。1.9硝酸银溶液((50g/L)o1.10银氨溶液：加氨水至硝酸银溶液(3.9)中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加氢氧化钠溶液(3.8)数滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。1.11维生素E标准液：a一生育酚(纯度95%)Y一生育酚(950o),S一生育酚(纯度95%)。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg。临用前用紫外分光光度计分别标定此三种维生素E溶液的准确浓度。1.12内标溶液：称取苯并「e」芘(纯度98%)，用脱醛乙醇配制成每1mL相当10ug苯并「e」芘的内标溶液。1.13pHl-14试纸。2仪器与设备2.1实验室常用仪器。2.2高效液相色谱仪带紫外分光检测器。2.3旋转蒸发器2.4高速离心机。。2.5高纯氮气。2.6恒温水浴锅。2.7紫外分光光度计。3分析步骤3.1试样处理3.1.1皂化：准确称取1g~10g试样(维生素E各异构体约为40ug)于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5mL10%抗坏血酸，苯并[el芘标准液2.00mL，混匀。10mL氢氧化钾((1+1)1混匀。于沸水浴回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。3.1.2提取：将皂化后的试样移入分液漏斗中，用50mL水分2次~3次洗皂化瓶，洗液并人分液漏斗中用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并人分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤人分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。3.1.3洗涤：用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层不显碱性(最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加)。3.1.4浓缩：将乙醚提取液经过无水硫酸钠(约5g)滤人与旋转蒸发器配套的250ml一300mL球形蒸发瓶内，用约100mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2ml乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚立即加人2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。3.1.5将乙醇液移入一小塑料离心管中((4.4.1)离心5min(5000r/min)。上清液供色谱分析如果试样中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容。并记下体积比。3.2标准曲线的制备3.2.1维生素E标准浓度的标定取各维生素E标准液若干微升，分别稀释至3.00mL乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算出该维生素的浓度。测定条件如表1所示。标准加入标准液的量V/uL比吸光系数E1%波长λ/nmα-生育酚γ-生育酚δ-生育酚100.0100.0100.07192.891.2294298298浓度计算按式（1）C1=××式中：C1—维生素浓度，单位为克每毫升(g/mL);A—维生素的平均紫外吸光值;V—加人标准液的量，单位为微升(PI);E—某种维生素1%比吸光系数;—标准液稀释倍数3.2.2标准曲线的制备本标准采用内标法定量，把一定量的a—生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚及内标苯并〔e」芘液混合均匀。选择合适灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程7000，为高浓度点。高浓度的1/2为低浓度点(其内标苯并「el花的浓度值不变)，用此种浓度的混合标准进行色谱分析，维生素标准曲线绘制是以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制，或计算直线回归方程如有微处理机装置，则按仪器说明用二点内标法进行定量3.3高效液相色谱分析3.3.1色谱条件(参考条件)3.3.1.1预柱:ultrasphereODS10um,4mmX4.5cm.3.3.1.2分析柱:ultrasphereODS5um,4.6mmX25cm,3.3.1.3流动相:甲醇+水=98+2.混匀。临用前脱气。3.3.1.4紫外检测器波长:300nm.量程。0.02.3.3.1.5进样量:20ul3.3.1.6流速:1.7ml,/min3.4试样分析取试样浓缩液20川，待绘制出色谱图及色谱参数后，再进行定性和定量。AE11003.00V×10-33.00V×10-33.4.1定性:用标准物色谱峰的保留时间定性。5.4.2定量:根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在标准曲线上查到其含量。或用回归方程求出其含量。计算结果见式（2）X=×V×式中：X—维生素的含量，单位为毫克每百克(mg/100g);c—由标准曲线上查到某种维生素含量，单位为微克每毫升(ug/mL);v—试样浓缩定容体积，单位为毫升(mL);m—试样质量，单位为克(g)。计算结果表示到三位有效数字Cm1001000