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环境微生物综训林晶晶大肠菌群MPN计数【实验目的】通过本实验学习和掌握食品中大肠菌群计数的方法。【实验原理】大肠菌群，即在一定培养条件下（37℃、24h之内）能发酵乳酸，产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括大肠埃希杆菌、产气肠杆菌、枸橼酸盐杆菌和副大肠杆菌。水中的病原微生物主要来自人和温血动物的分辨，但是水中的病原微生物分析难度大，对分析者也有危害，大肠菌群在水中生存时间与病原菌基本相同，而且在粪便中数量最多，检出技术上也较为方便，最适合充当水污染的卫生指标。目前检测大肠菌群的标准分析方法是多管发酵法，以最可能数（mostprobablenumber，MPN）来表示检测结果。MPN是基于泊松分布的一种间接计数法。我国《生活饮用水卫生标准》规定：生活饮用水中大肠菌群数1L不能超过3个。【设备和材料】除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36℃±1℃冰箱：2℃～5℃天平：感量0.1g无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头菌锥形瓶：容量500mLpH计或pH比色管或精密pH试纸菌落计数器【培养基和试剂】月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2无菌生理盐水：见附录A中A.3无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.4无菌1mol/LHCl：见附录A中A.5环境微生物综训林晶晶【检验程序】【操作步骤】1样品的稀释1.1以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。1.2样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。1.4根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样环境微生物综训林晶晶品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。2初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养48h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。3复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。4大肠菌群最可能数（MPN）的报告按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每mL样品中大肠菌群的MPN值。环境微生物综训林晶晶附录A（规范性附录）培养基和试剂A.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1000mLpH6.8±0.2A.1.2制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。A.2煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤A.2.1成分蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200mL0.1%煌绿水溶液13.3mL蒸馏水800mLpH7.2±0.1A.2.2制法将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。A.3无菌生理盐水A.3.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000mLA.3.2制法称取8.5ｇ氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.41mol/LNaOHA.4.1成分NaOH40.0g蒸馏水1000mLA.4.2制法环境微生物综训林晶晶称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.51mol/LHClA.5.1成分HCl90mL蒸馏水1000mLA.5.2制法移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL，121℃高压灭菌15min。附录B（规范性附录）大肠菌群最可能数（MPN）检索表B.1大肠菌群最可能数（MPN）检索表每g（mL）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表B.1。