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北京师范大学化学学院化学综合实验实验报告课程名称：以α-胰凝乳蛋白酶为催化剂在有机溶剂中合成N-保护的亮-脑啡肽三肽片段实验时间：____2015.9.23—2015.10.28__实验地点：基础化学实验中心化学综合实验室专业年级：________2013级2班学生姓名：_____________张钰___________学号：___________201311151046______指导老师：____________邢国文______________以α-胰凝乳蛋白酶为催化剂在有机溶剂中合成N-保护的亮-脑啡肽三肽片段张钰北京师范大学化学学院摘要：推荐一个面向理科高年级本科的化学生物学综合实验。以二氯甲烷为溶剂，使用α-胰凝乳蛋白酶为催化剂合成N-保护的亮-脑啡肽三肽片段。关键词：综合实验化学生物学酶促合成亮-脑啡肽α-胰凝乳蛋白酶一、实验目的1、在做实验的同时开阔视野，了解一些近年来学科交叉研究领域的研究热点；2、熟悉一些化学生物学实验的基本实验方法与技巧，为今后的进一步科研深造奠定坚实的实验基础；3、通过本课程的训练，有效的提高独立科研能力和科研创新能力；4、通过四步反应（独立完成三步）合成N-保护的亮-脑啡肽三肽片段；二、实验原理本实验以酪氨酸（Tyr）、双甘肽（Gly-Gly）为起始原料，经过四步反应得到了N-保护的亮-脑啡肽前三肽Z-Tyr-Gly-Gly-OEt。1、酪氨酸在氯化亚砜的作用下酯化，得到酪氨酸乙酯盐酸盐（HCl·Tyr-OEt）；2、酪氨酸乙酯与苄氧羰酰氯（Z-Cl）在碱性条件下反应，得到苄氧羰酰酪氨酸乙酯（Z-Tyr-OEt）；3、Gly-Gly在氯化亚砜作用下酯化，得到甘胺酰甘氨酸乙酯盐酸盐（HCl·Gly-GLy-OEt）；4、Z-Tyr-OEt与Gly-GLy-OEt在二氯甲烷中以α-胰乳蛋白酶催化得到亮-脑啡肽的前三肽，即N-保护的苄氧羰酰酪氨酰甘胺酰甘氨酸乙酯（Z-Tyr-Gly-GLy-OEt）。三、实验药品药品名形状分子量nDdmp/°Cbp/°C溶解性水乙醇乙醚乙醇无色液体461.36140.79-117.378.5易溶易溶易溶氯化亚砜淡黄色发烟液体118.96\1.64-10578.8分解易溶易溶Gly-Gly白色叶状结晶或片状晶体，有光泽132.12\\262\溶难不Tyr白色结晶粉末181.20\1.456342\难不不乙醚无色透明液体74.121.350.7134-116.334.6微溶溶HCl-Tyr-OEt白色结晶245.7\\\\溶溶溶HCl·Gly-GLy-OEt白色结晶196.6\\\\溶溶溶乙酸乙酯无色液体88.111.37190.902-83.677.2溶溶溶碳酸氢钾白色晶体100.12\\\\溶不不苯甲醇无色液体108.131.53961.0419-15.3205.7溶易易苄氧羰酰氯无色有刺激性气味的液体170.5\\\\分解溶溶硫酸镁白色粉末120\2.66\112.4溶微不石油醚无色透明液体\\0.64～0.66\40～80不溶溶Z-Tyr-OEt白色晶体343\\\\\\\Z-Tyr-Gly-Gly-OEt白色晶体449.1\\\\\\\三乙胺无色油状液体，有强烈氨臭101.191.40100.726-114.889.5微溶溶丙酮无色液体58.080.78451.3588-94.756.05溶溶溶四、实验步骤（1）、HCl·Gly-Gly-OEt的合成①、取8Ml无水乙醇，用冰盐浴冷至-10℃，缓慢加入2Ml氯化亚砜，加完后继续搅拌20min。②、加入Gly-Gly1.0g，先初步摇匀，放入磁子，用磁力搅拌器室温搅拌3天。③、用旋转蒸发仪减压除去溶剂得到白色固体。④、用乙醇-乙醚重结晶：先用3mL乙醇微热，将固体溶解；在逐步加入乙醚，刚开始一段时间没有晶体析出，用玻璃棒摩擦瓶壁，很快析出大量白色结晶。⑤、抽滤。烘干并称重，记录质量m1=1.16g。（2）、Z-Tyr-OEt的合成：①、将HCl·Tyr-OEt0.8g悬浮于16mL乙酸乙酯中，加入KHCO32g的13mL水溶液，冰浴下快速搅拌，15min内滴加Z-Cl的苯甲醇溶液0.7Ml。②、加完后搅拌20min，撤去冰浴，室温再搅拌2-3h。③、反应结束后用4mol/L的盐酸酸化，使水相的pH为1，分出有机相，用水、饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥。④、减压蒸除溶剂后，得到黄色油状物，置于冰水中，缓慢结晶，过滤得第一批晶体；在母液中加入缓慢加入石油醚再结晶得第二批晶体，共得产物称重，记录质量m2=0.64g。（3）、以α-胰凝乳蛋白酶合成Z-Tyr-Gly-Gly-OEt。①、取0.425gZ-Tyr-OEt与HCl·Gly-GLy-OEt0.25g悬浮于12.5mL二氯甲烷中，加入三乙胺350uL并在搅拌使底物完全溶解；②、调节pH值约为10，反应液为均一透明溶液；③、加入α-胰凝乳蛋白酶5mg和用注射器加入50uL水。室温下搅拌反应1-2天，反应液中有白色沉淀产生。④、反应3天后，测反应后体系的pH，将反应液过滤，滤饼依次用二氯甲烷、1mol/L盐酸、去离子水洗涤。在红外灯下烘干产物，称重记录质量m3=0.2g。五、实验数据记录和处理（1）HCl·Gly-Gly-OEt的产率：m1=1.16gM理论=1.2gw=m1/M理论×100%=96.7%;（2）Z-Tyr-OEt的产率：m2=0.64gM理论=0.8gw=m/M理论×100%=80%,产物颜色偏黄，可能有副产物生成，或者是洗涤不够充分，所以测量产率偏高（3）Z-Tyr-Gly-Gly-OEt的产率：m3=0.2gM理论=0.625gw=m/M理论×100%=32%产率低，并且产物不能溶于丙酮。可能所得产物不是目标产物，而是副产物或者是反应物。原因分析：①、反应物为上一次实验所得的产物，可能含有杂质，影响到此次的实验；②、操作过程中，水的滴加速度过快，且没有控制好用量，加得过多，而水的含量过多会使酶的活性降低；六、实验思考与讨论1、冰盐浴：冰盐浴的降温原理与溶液的凝固点下降有关。当食盐和冰均匀地混合在一起时，冰因吸收环境热量稍有融化变成水，食盐遇水而溶解，使表面水形成了浓盐溶液。由于浓盐溶液的冰点较纯水低，而此时体系中为浓盐溶液和冰共存，因此体系的温度必须下降才能维持这一共存状态（浓盐溶液和冰的共存温度应该比纯水的冰点更低）。这将导致更多的冰融化变成水来稀释浓盐溶液，在融化过程中因大量吸热而使体系温度降低。一般能降到-20℃。2、氯化亚砜：遇水遇热易分解：SOCl2+2H2O===H20+SO2+2HCl在HCl·Gly-GLy-OEt、HCl·Tyr-OEt合成中的作用：A.作为氯化剂；B.使成酯反应更易进行，与一般酯化不同的是，在氯化亚砜的作用下，酯基中的两个氧原子都来自于羧基。3、双溶剂重结晶的适用条件及操作混合溶剂重结晶：原理：某种有机物在某溶剂中溶解度很好时，先用最少量的该溶剂加热溶解，再加入溶解度稍差的另一种溶剂，降低该有机物的溶解度，然后降温析出晶体。混合溶剂重结晶步骤：①、按照选择溶剂的方法，试出混合溶剂各自量的比例②、将被重结晶物质加热溶解于适量的易溶溶剂中③、趁热过滤，以除去不溶性杂质④、用滴管逐滴加入热的不易溶的溶剂，直至出现浑浊，且不再消失为止⑤、再加热使其澄清，若不澄清，可再加较少量的易溶溶剂，使其刚好澄清⑥、将此热溶液在室温下放置，冷却析出晶体本实验中C2、C3、C5提纯均用到双溶剂法（又称反溶剂法）重结晶，即先将待提纯物质溶于少量良溶剂（产品在溶剂中溶解性很好），可适当加热，并及时滤去不溶性杂质，确保溶液澄清透明。然后将大量不良溶剂（产品溶解性较差）注入到溶液中等待结晶。注意事项：①：若局部结晶过快导致晶型不佳，可沿瓶壁缓慢滴入，且勿震荡过猛；②：若晶体不敏感，则注入适量不良溶剂再震荡即可，也可以加晶种诱导结晶。③：注意良溶剂与不良溶剂需互溶。4、影响有机溶剂中酶促反应的因素：酶在各种有机溶剂体系中表现出来的催化性质(包括酶的活性、稳定性及专一性)相差甚远,主要取决于反应体系中水的含量和所选用的溶剂。（1）、溶剂的影响：溶剂对酶的影响体现在其对酶的蛋白质结构、分子柔性以及活性中心的作用。α-胰凝乳蛋白酶在有机溶剂中具有较高的稳定性；（2）、水的影响：①、水的含量：微量的水对酶在有机介质中的活性影响很大。酶在完全干燥的溶剂体系里基本上是不显催化能力的,但是其活力会随着体系里水含量的增加而明显加速。②、水溶液的pH值：α-胰凝乳蛋白酶在pH=10.0的缓冲液中的稳定性最高,在pH=5.0的缓冲液中其次,在pH=7.0的缓冲液中最低。