绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白分子标记在环境微生物学研究中的应用摘要：荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。近年来，来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。其中绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP，来源于水母)具有独特的应用价值。GFP及GFP突变体在微生物降解污染物、生物膜菌群构架、环境生态学和环境检测生物传感器等研究领域取得了很好的应用效果。关键词：绿色荧光蛋白，环境微生物，分子标记自然界中的许多生物都具有发光的能力，如细菌、真菌、萤火虫、深海鱼类和腔肠动物等。它们的发光能力是由一类称为“荧光蛋白”的蛋白质赋予的。GFP标记系统是首次发现的不需要其他辅助条件的生物发光标记系统。GFP的激发光谱和发射光谱在活体和离体条件下完全相同，而虫荧光酶素的发射光谱在离体和活体条件下并不相同[1]。绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用[1]2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。天然的GFP是一种多肽，由238个氨基酸组成，分子量27ku。能够将蓝光转化成绿色荧光[2-3]。Cormack等用定点突变的技术将包围Ser—Tyr—Gly生色团的20个氨基酸进行突变，得到一系列吸收峰红移的突变体。这些突变体相对于野生型蛋白具有更高的折叠效率，荧光强度增强30～100倍，使GFP的应用前景更加广阔[5]。作为报告基因，gfp基因具有很多优良的特性：它表达出来的GFP折叠效率高，可以在多种生物体内表达；无论是直接表达还是以融合蛋白形式表达，GFP对宿主细胞或组织均无毒害作用；GFP的激发不消耗生物能量，不需要任何底物或辅因子；稳定性好，能耐受穿透、毒素、光漂白等不利因素，在甲醛固定、65℃处理0．5h以及pH值6～l2范围内均十分稳定；用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计等仪器，可以对标记的目标微生物进行实时、原位的监测，或定量计算其荧光强度[7]。上述特性使得GFP作为分子标记物在基因工程微生物(Geneticallyengineeredmicroorgan—isms，GEMs)中得到广泛的应用。目前GEMs在有害生物综合治理、有毒化学物质及重金属污染修复、污水处理等领域发挥着重要的作用。GEMs处理相对于化学或物理的处理更加经济有效，并且可以降低给环境带来的潜在的危害。在不同的样品中带有GFP标记的细菌可以通过荧光显微镜直接观察空间位置或特定基因表达等信息，因而为环境微生物群落的研究提供了极其有利和方便的手段。1、微生物降解污染物的研究某些自然界细菌的细胞代谢过程能降解或矿化一种污染物，实验中将这些细菌添加到含有污染物的环境中，用于降解目标污染化合物。通过考察样品中细胞数和存活情况、代谢活力以及细菌空间位置与降解能力之间关系等重要因素，以揭示生物降解过程的规律。而使用GFP分子标记使研究者更加容易检测被标记细胞在样品中的动态信息，如有关的细胞数目、存活情况和空间分布等。例如：将带有GFP分子标记的细胞接种到土壤微生态系统，可提高土壤对带有“C标记苯酚的矿化能力，而通过荧光显微镜可以方便地监测GFP标记细胞在苯酚污染的土壤微生态系统中的存活情况。2、生物膜和活性淤泥菌群研究GFP分子标记系统也是研究生物膜上菌落持征或生物膜生长特性，以及附在活性淤泥絮凝物中菌群的有利手段近年来，国内外很多学者通过生物膜反应器进行废气处理，取得较好效果，但对生物膜的生长和菌群架构特征了解甚少。3、植物与根际微生物相互作用在自然界，植物与微生物紧密联系在一起。某些微生物在土壤中的存在，对植物的生长起到一个重要的作用，如根瘤菌。但对微生物与植物的相互作用，以及它们在根际的分布情况了解甚少。随着GFP分子标记系统的出现，为研究提供厂一种便利的监测手段。WenboMa等nIl研究发现KluyveraascorbataSUD165／26菌株对在重金属污染的土壤中生长的植物有明显的促进作用，通过GFP分子标记该菌株．考察其与植物根的关系，发现大部分的细菌紧密地附在植物的根际表面形成菌群，且大多数的菌群附于根际的上2／3位置，而在根的顶端没有菌群。4微生物土壤修复微生物在污染土壤修复中起重要作用，但对微生物如何转移集中到污染的位置进行污染物的生物降解以及微生物移动的控制因素(如土壤空隙率、土壤中的矿物质、土壤颗粒的大小等)了解甚少。由于对被转运细菌的难以识别、鉴定，常常限制了在实验室和田地里的细菌转运机理探索实验。GFP分子标记技术可以很好地解决这个问题。5环境监测用生物传感器将报告基因与特定代谢基因启动子融合，而待测特定污染物则为该代谢基因的诱导物，据此设计的生物传感器可以方便进行该污染物的检测。GFP基因则是这种报告基因之一，因而已有报道利用GFP为报告基因的生物传感器用于环境中污染物的测控。如有特定的污染物，就开启代谢基因启动子，生物传感器发出绿色荧光。结语GFP作为一种新型分子标记系统，已成为研究环境中复杂生物系统的有效工具。通过比较，可知GFP标记系统比现有的标记系统具有更多的优势，特别在微生物的空间分布研究和原位实时在线监测上。但在环境中应用GFP标记还受到两个方面的限制。其一，在自然环境下质粒的稳定性。研究发现在细菌的传代过程中有质粒丢失和转化的现象。因此在被用于生态学研究的菌株最好做染色体单拷贝基因标记，使遗传稳定性最大化，减少遗传标记转化到其他微生物。其二单拷贝的GFP标记对单细胞的检测灵敏度非常低。为确保标记细菌的单细胞检测，可将绿色荧光增强型的GFP红移突变株和细菌强启动子融合。