绿茶水提物对Hela细胞体外增殖的抑制

科研训练报告绿茶水提物对Hela细胞体外增殖的抑制学院专业班级学号姓名时间地点指导教师目的：通过科研训练，让学生初步了解中草药对肿瘤细胞增殖抑制的研究方向，培养学生检索和阅读中英文文献资料的能力，培养学生独立完成实验的能力，能够对实验中的现象进行讨论和简单的结果分析，为实验论文的书写奠定良好的基础，能够完成科研训练报告的撰写。主要内容：1.学会使用网络工具查阅资料，以“细胞体外培养，肿瘤细胞，绿茶水提物，”等为关键词进行资料的查询；2.对查得的资料进行分析；3.完成绿茶水提物与肿瘤细胞的联合培养；4.对实验中的现象进行讨论和简单的结果分析；5.撰写科研训练报告。指导教师评语：成绩评定签字年月日注：本页由教师填写绿茶水提物对Hela细胞体外增殖的抑制摘要：本研究通过细胞体外培养、MTT比色法等方法，研究绿茶水提物(GreenTeaExtract，GTE）对Hela子宫颈癌细胞体外增殖的抑制作用。实验结果表明：随着绿茶水提物浓度的增加，绿茶水提物对细胞的增殖抑制作用越明显，其中浓度为90mg/ml的绿茶水提物对Hela子宫颈癌细胞的增殖抑制作用最明显,绿茶水提物对Hela子宫颈癌细胞的半致死抑制浓度IC50值为102.515。关键词：绿茶水提物肿瘤细胞增殖抑制StudyofGrowthInhibitionEffectofGreenTeaExtractonHelaCellsAbstract：Thisstudyusesvitrocellculture,MTTassayingtostudygreenteaextract(GTE)controllingHelacellsistoreproduce.ExperimentalresultsshowthatwithincreasingconcentrationofGTE,GTEonHelacervicalcancercellproliferationmoreobviously,andtheinhibitedtheproliferationisthemostobviouslywhentheconcentrationof90mg/mlofGTEoncervicalcancercells,thevalueofGTEforHelacervicalcancercelllineHelainhibitoryconcentration(IC50)is102.515.Keywords:GreenTeaExtract;tumorcells;proliferation;Inhibition前言宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌和结直肠癌的第3个常见的恶性肿瘤，在发展中国家是仅次于乳腺癌居第2位常见的恶性肿瘤是最常见的女性生殖道恶性肿瘤。全球每年新发的宫颈癌病例大约在50万左右，其中80%发生在发展中国家。我国每年新发宫颈癌病例13万以上，大约占世界每年新发宫颈癌病例的三分之一，这是很高的数字。宫颈癌发病率就目前来讲，仍然是女性生殖道恶性肿瘤的首位！这是一个非常值得大家关注的疾病，在2004年-2010年《中华癌症预防与控制规划纲要》已经明确地将宫颈癌列为我国十大重点防治的癌症之一。目前，饮食中的化学防癌物成为人们的研究热点，因为有些植物的化学成分能阻止人体内致癌物的形成，比如绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)，是茶多酚中含量最高、活性最强的单体[1]，具有抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡的活性[2]。RECK基因在多种正常人体组织中均表达，是新发现的一种基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）抑制剂，是由Takahashi[3]等在转染v-Ki-ras的细胞株NIH-3T3中分离出来的一种转录抑制基因。而基质金属蛋白酶-2（MMP-2）是引起细胞外基质(ECM)降解的最重要的酶类之一，参与炎症、组织纤维化、新血管形成和肿瘤的侵袭转移等过程[4-7]。最新研究表明，EGCG能显著抑制结肠癌细胞转移和侵袭[8]，MMP-2表达降低也能减弱LOVO结肠癌细胞的侵袭活性[9]。为了进一步证实其中的联系，本研究拟采用不同剂量的EGCG处理人结肠癌HT-29细胞不同时间，观察其增殖和凋亡的变化，同时检测RECK和MMP-2mRNA和蛋白表达水平的改变，来进一步探讨其机制。本研究采用了传统的中药煎煮法制备了绿茶水提物，通过绿茶水提物与HeLa细胞的共同培养，探索绿茶水提物对HeLa细胞的体外增殖抑制作用。一、实验材料1.1样品、试剂、仪器1.1.1提取物的制备(1)秤取4g绿茶，浸泡后将其剪碎；(2)加入200mL超纯水，移置电磁炉，使其大火煮沸，后小火继续煎煮4小时，采用8层纱布进行过滤；(3)将滤渣重复步骤2两次，每次4小时；(4)将三次所得滤液进行合并，60℃水浴浓缩，离心（4500rpm，15min），弃去沉淀，所得上清液即为绿茶提取物（GreenTeaExtract）。进行冷冻干燥后再次充分溶解于无菌培养基中，制备原始药物浓度为100mg/mL，将所得溶液进行0.22μm滤膜过滤除菌。实验时，用无菌RPMI-1640培养液稀释成所需浓度。1.1.2试剂(1)1640培养基（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；胰酶（Trypsin，长春天佳公司）；噻唑兰（MTT，Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）；(2)绿茶（龙井）（购于长春理工大学，产地：浙江杭州）。1.1.3仪器CO2培养箱（日本三洋公司）、酶标仪二、实验方法2.1体外实验方法2.1.1细胞培养及传代将Hela细胞用含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640完全培养液按1×105个/mL的浓度接种于无菌培养瓶内，置于37℃、饱和湿度、CO2浓度为5%的培养箱内。0.25%胰酶消化液消化传代，3~4天传代1次。实验所用Hela细胞均处于对数生长期。2.2MTT法检测GTE对Hela细胞的影响将Hela细胞用含8%灭活胎牛血清、1%双抗的RPMI-1640完全培养液按1×105个/mL的浓度接种于培养瓶内，置于37℃、饱和湿度、5%CO2（95%空气）培养箱内。0.25%胰酶消化传代，3~4天传代1次。实验所用Hela细胞均处于对数生长期。采用MTT比色法检测绿茶水提物（GreenTeaExtract）对Hela细胞的增殖抑制作用。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至105个/mL，取若干块无菌96孔细胞培养板，使每孔加入100μL含有上述悬浮细胞的培养液，静置，移至培养箱内培养24h后，弃去原培养液。加入不同浓度的绿茶水提物，用培养液补足至100μL，使每孔中药物的终浓度为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL，对照组加空白培养液。每组设6个复孔。将培养板置于37℃、饱和湿度、5%CO2（95%空气）培养箱中培养1d后，取出培养板，每孔加入10μLMTT溶液，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入100μLDMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。每组实验重复3次。在酶标仪上以空白孔调零，测定在490nm波长处各孔的吸光度值。计算细胞增殖抑制率，计算IC50值，以时间、浓度为横轴，光吸收值（A）、增殖抑制率为纵轴绘制相应曲线。抑制率=（1-A490加提取液组细胞吸光值/A490对照组细胞吸光值）×100%2.3统计学方法所有数据采用SPSS19.0软件进行统计处理，组间数据采用独立样本t检验法进行两两比较分析，P0.05表示差异有统计学意义。MTT实验中的数据采用Origin8.0软件进行线性拟合计算。（三）结论3.1倒置显微镜观察绿茶水提物对Hela细胞形态的影响当绿茶水提物作用于Hela细胞1d时，通过倒置显微镜观察不同组别细胞形态的差异，如图所示。（1~9）图依次表示绿茶水提物浓度为10mg/mL组、20mg/mL组、30mg/mL组、40mg/mL组、50mg/mL组、60mg/mL组、70mg/mL组、80mg/mL组、90mg/mL组细胞的形态。由1图知，正常组贴壁细胞数目较多，细胞基本形成膜片形，细胞呈扁平、不规则多角形，细胞边界清晰，细胞折光性良好。随着绿茶水提物浓度的增高，Hela细胞逐渐出现脱水现象、逐渐发生皱缩、逐渐失去贴壁时候的触角。5组细胞基本呈圆形，细胞脱水现象严重，大量细胞因凋亡而脱壁，显微镜下观察培养液中有大量的悬浮的细胞碎片。因而，通过倒置显微镜的观察，我们发现当绿茶水提物浓度越大，对Hela细胞形态改变的影响越大，这就再次说明了绿茶水提物对Hela细胞能够产生增殖抑制作用，且绿茶水提物浓度越大对Hela的增殖抑制作用越强。123456789图1.倒置显微镜观察到的不同浓度绿茶水提物作用下细胞形态3.2不同浓度绿茶水提物对Hela细胞体外增殖的影响根据MTT比色法所得实验数据可知，不同浓度的绿茶水提物均对Hela细胞起到不同程度的增殖抑制作用，不同浓度的绿茶水提物作用后的Hela细胞的OD值如图1所示。由该图知，当实验进入1d时，除第一组（10mg/ml）外各实验组的OD值均低于正常control组的OD值。通过观察，当浓度大于10mg/ml，药物实验组的OD值要低于正常组的OD值，同时伴随绿茶水提物的浓度的增大，OD值呈下降趋势，这表明实验组的细胞数量要少于正常组的细胞数量且伴随着绿茶水提物浓度的升高细胞数量呈相应的减少趋势。该现象说明浓度大于10mg/ml的绿茶水提物对Hela细胞的体外增殖产生了一定的抑制作用，同时伴随绿茶水提物浓度增大对Hela细胞的增殖抑制能力增强。对MTT实验数据进行分析，绘制不同浓度绿茶水提物组对Hela细胞作用时间为1d的OD值曲线如图2所示。经计算得到绿茶水提物对Hela细胞作用1d的IC50值为：102.515mg/ml。增殖抑制曲线如图3。细胞增殖抑制影响OD值平均值变化曲线0.40.50.60.70.80.911.10102030405060708090mg/mlOD图2（不同浓度绿茶水提物对Hela细胞增殖抑制影响OD值平均值变化曲线）抑制率曲线IR（%）-mg（ml）y=0.0584x-0.108R2=0.9494-0.100.10.20.30.40.5102030405060708090mg/mlIR(%)IR线性(IR)图3不同浓度绿茶水提物对Hela细胞的抑制率曲线（四）实验结果讨论绿茶药理作用广泛，对于绿茶能抑制肿瘤细胞增殖和诱导其凋亡的报道越来越多。本研究通过采用MTT法，了解HeLa细胞对WEGT的敏感性。形态学能最直观地反映细胞的生存状态。本实验对所培养的细胞进行连续的动态观察，发现不同浓度的GTE作用HeLa细胞d均可引起明显的细胞皱缩，甚至脱壁死亡，细胞死亡表现出药物剂量和时间的依赖性效应。实验结果表明：随着GTE浓度的增加，GTE对HeLa细胞的增殖抑制作用越明显，其中浓度为90mg/ml的GTE对HeLa细胞的增殖抑制作用最明显，GTE对HeLa细胞的半致死抑制浓度IC50值为102.515。讨论：由于本次试验在浓度梯度设置较小，故只能用最大浓度来表示抑制作用最强点。科研训练心得：1.通过科研训练，我了解了一些有关万方、维普等相关数据库的信息，且掌握了如何去查找所需要的相关信息。2.了解了HeLa细胞对女性健康的危害，以及我们平常生活中减少此危害的方法。3.进一步熟悉了细胞培养的相关知识。参考文献[1]SaitoST,GosmannG,PungartnikC,etal.Greenteaextract-patentsanddiversityofuses[J].RecentPatFoodNutrAgric.2009,1(3):203-215[2]SadavaD,WhitlockE,KaneSE.Thegreenteapolyphenol,epigallocatechin-3-gallateinh