缓冲液的使用

缓冲液的使用生物化学主要是研究生物大分子及其相互作用的科学，而生物大分子是存在于生物的基本单元—细胞、细胞间液或体液中的。生物大分子在活细胞内的特定存在条件（pH、离子强度及其他生物大分子的相互制约）下，不仅能保持其结构的完整而且能保持一定的生物活力。研究生物大分子的结构和功能，至今尚未找到一种在细胞内即可进行的方法。因此，人类若想研究生物大分子的结构和功能，从而在分子水平上阐述生命现象的本质，就必须先把生物大分子从细胞或机体内完整、纯净且保持其活力地分离出来。因此，当我们将组织或细胞破碎并在体外（invitro）分离纯化和研究其生物大分子的结构和功能时，就必须时刻注意保持其结构的完整性并维持活力！若想做到这一点，我们就必需从细胞破碎开始（生物大分子马上失去了其赖以保持活力的制约条件），时刻注意为这些“离体”的生物大分子提供保持结构完整，维持其活力的环境条件。这种条件不是水、去离子水等能提供的。也就是说，我们要为生物大分子提供一个相对稳定而适宜的pH环境、合适的离子强度及其他外界条件。同样的，在组织和细胞培养、器官培养等细胞生物学，组织和病理学以及许多生命科学研究的体外培养和体外实验中，也需要模拟器官、组织和细胞等的生理环境以维持其基本的代谢和生物特性或生命特征。毫无疑问的，在所有这些实验中，所用液体的基础溶液都是缓冲液。缓冲液是溶液中维持溶液pH相对稳定，能“中和”外加酸或碱的化学成分。一般来说，缓冲液是弱酸及其共轭碱（如乙酸和乙酸纳）或弱碱及其共轭酸（如氨和氯化铵）组成的溶液，其中的弱酸及其共轭碱或弱碱及其共轭酸则称缓冲对。选择缓冲液的依据是它的pKa值及其化学性质。缓冲液在pH=pKa±1的范围内是最有效的。超出这个范围，无论是还是碱浓度都太小，不能有效抵抗外加酸或碱的影响。而溶液缓冲能力的大小，则取决于缓冲对两个组分的浓度。选用缓冲液时，还应考虑缓冲液总的离子强度。由于温度可影响某些弱酸和弱碱的解离，因此也影响pH值。所以配制缓冲液时务必要考虑环境温度变化对缓冲液pH的影响。在生命科学研究中，缓冲液的化学性质特别重要。选用缓冲液时不仅要考虑缓冲对的溶解度、稳定性，还要考虑与系统中其它离子或化学成分的相互作用，以及光吸收和对生物系统功能的潜在抑制作用或刺激作用。使用缓冲液时应注意的一些事项1.向缓冲液中添加一些必要的稳定剂（如巯基保护剂——乙醇、多元醇、甘油、蔗糖、乙二醇、DDT等），以保护生物大分子重要的活性基团或空间结构。2.添加金属离子或络合剂，以保护对金属离子敏感（需要或不需要）的生物大分子。有些酶需要两价的金属离子（如Ca++,Mg++,Mn++等）作为其辅因子；有些生物大分子则要时刻防范上述酶类（如DNase，Nuclease等）对它们的降解，故要向缓冲液中添加EDTA或EGTA等螯合剂，以保护它们不被降解。3.添加蛋白酶抑制剂。如我们要研究蛋白质分子，在分离纯化他们的过程中，必须时刻防止他们被蛋白酶所水解。为此可向缓冲液中添加PMSF（苯甲基磺酰氟）或DFP（磷酸二异丙基氟），亮抑肽等。它们可分别抑制哺乳动物蛋白酶或丝氨酸蛋白酶的活力。4.蛋白质添加剂：生物大分子需要有一定的浓度，才能保持其完整的空间构像。因此，经过一系列分离纯化步骤而最终得到纯酶制品时，有时其浓度很低。为保持这类浓度很稀的纯酶的活力，往往要向这类酶制品（特别是一些商售的限制性核酸内切酶）中人为地添加一些蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或酪蛋白（Casein）等，从而既保护了目的酶的空间构象又不影响其活力。5.渗投压：在组织和细胞的体外培养、保存或洗涤等实验中，除了溶液的酸碱度，营养成分和与其它离子或化学成分的相互作用外，还要注意液体的渗投压。低渗可导致溶血或细胞膜破裂，高渗引起细胞皱缩或抑制细胞代谢。有的缓冲对浓度稍高，即可因其与其它离子或化学成分相互作用而影响溶液的稳定性或对细胞的功能产生副作用，因此，为了不使某一缓冲对的浓度过高，可以在同一个溶液中添加多个不同的缓冲系统；为了保持溶液处于等渗状态，避免高渗或低渗的出现，常通过添加氯化钠等中性盐的方法调整溶液的渗投压，如在磷酸缓冲液（PB）中添加氯化钠配制成磷酸盐缓冲液(PBS)。