试论微生物蛋白酶

1试论微生物蛋白酶中文摘要：目前低温蛋白酶的研究己经引起世界各国学者们的关注。随着对低温蛋白酶研究的深入，将会有更多行业应用低温蛋白酶。蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。关键词：低温蛋白酶、测定、提取、纯化、应用前景2目录一、中文摘要、关键词…………………………………………………2二、目录…………………………………………………………………3三、论文正文……………………………………………………………4（1）第一章蛋白酶的提取方法……………………………………4（2）第二章蛋白酶的纯化方法……………………………………5（3）第三章低温中温高温蛋白酶以及其作用……………………6（4）第四章蛋白酶的检测方法…………………………………8（5）第五章低温蛋白酶的应用前景，存在的问题………………9四、参考文献……………………………………………………………103蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的月示和胨。外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶。按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。催化蛋白质水解的酶类。种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。第一章蛋白酶的提取方法目前国内对蛋白酶的分离技术主要是应用有机溶剂提取法、盐析法、或底物亲和法进行粗分离后,得到混合的胃酶(包括胃蛋白酶A、B、C、D),但应用到生产中的只有有机溶剂提取法和盐析法。国外则对此研究较早,主要集中在20世纪六七十年代,经盐析得到了商业结晶胃蛋白酶。1.1有机溶剂沉淀法有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩,通常使用的有机溶剂有乙醇和丙酮。此种方法是利用生化物质在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异而实现分离的[1.2盐析法蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度,以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液,中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质,于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时,中性盐加入蛋白质溶液后,由于离子强度发生改变,蛋白质表面电荷被大量中和,更加导致蛋白溶解度降低,使蛋白质分子之间聚集而沉淀[441.3底物亲和法底物亲合法是利用酶(胃蛋白酶)与其底物(酪蛋白)的亲和性,从胃黏膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH2�5的乳酸缓冲液中充分结合,然后调pH至4�0(底物的等电点)沉淀底物和酶的结合物,随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中,添加低浓度的SDS将底物和酶分离,得到酶-SDS复合物,再进一步分离纯化。陈躬端(2001)成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离,得率大约为30%。与传统的分离方法比较,此法具有简单高效的优点,为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用,同时具有较高的特异性第二章蛋白酶的纯化方法[1.1凝胶过滤凝胶过滤主要是利用凝胶的多孔性,当样品溶液通过凝胶柱时相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔,而只是沿着凝胶颗粒的孔隙随着溶剂首先流出层析柱[1.2离子交换层析离子交换法一直以来都是酶生产所常用的方法。它是一项利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术。具有简便、高效、成本低,且可自动化连续操作的优点1.3双重层析配合法为了获得高活力的胃蛋白酶,还常将两种层析方法配合使用。张继平(2004)对暗纹东方鲀胃蛋白酶的纯化时,采用CM-Cellulose柱纯化(2�5cm!30cm),洗脱液为0�05mol/LpH5�0柠檬酸缓冲液,01�0mol/LNaCl直线梯度洗脱,流速为0�25mL/min,部分收集,每管收集约4mL,合并活力峰,再经SephadexG-75(2�5cm!60cm)层析柱,获得胃蛋白酶比活为7�13�mol/(min∀mg)[7]。基于以上对胃蛋白酶的分离纯化技术的比较分析可以看出,长期以来分离提取技术一直没有取得较大的突破,用有机溶剂、盐析等技术得到的天然胃蛋白酶产品,纯度、生物活性愈将不能满足医药品和工业日益增长的需5要。随着分离科学技术的不断发展,采用新型分离技术分离胃蛋白酶已势在必行。因此,笔者认为以下几种技术是胃蛋白酶分离纯化的方向。1.3.1有机溶剂与盐析共沉淀有机溶剂和盐析法都是分离纯化胃蛋白酶的传统方法,有其各自的特点。如果将有机溶剂和盐析配合使用,不仅可以降低盐的用量,而且可以不同程度的消除各自分离纯化所带来的问题,得到的胃蛋白酶纯度和活性也会有所增加。此法在实验室的研究中已见报道,但在工业生产中,有机溶剂与盐的用量还有待进一步优化。1.3.2膜分离技术分离膜是一种特殊的、具有选择性透过功能的薄层物质,能利用分子大小实现分离,从而起到浓缩和分离纯化的作用[12]。由于其可在维持原生物体系环境的条件下实现分离,并可高效地浓缩、富集产物,有效地去除杂质,加之操作简单,结构紧凑、能耗低,过程简化,无一次污染,也将成为胃蛋白酶分离纯化工艺的研究方向。1.3.3等电点沉淀与底物亲和法胃蛋白酶具有极低的等电点(如猪胃蛋白pH1�0),但胃蛋白酶的分离纯化技术中等电点沉淀法未见报道,如果此方法可实现,那将大大缩短分离纯化的时间。底物亲和法是分离纯化胃蛋白酶的新亮点,但其工艺条件还不成熟,尤其是在分离底物和酶的复合物时,SDS的添加量有待研究。第三章低温中温高温蛋白酶以及其作用低温蛋白酶主要存在于低温微生物中，而低温微生物广泛分布于极地、冰川、永久冻土和深海等寒冷环境,其冷适应能力是多种机理共同作用的结果,包括酶的低温催化活性、低温下膜流动性的保持、冷休克蛋白、抗冻蛋白以及抗冻保护剂等。低温微生物主要应用于催化低温发酵、表达热不稳定蛋白质、生产抗冻保护剂和冬季治理污水等领域。早期对低温适应机理的研究多集中在嗜冷酶的分离和特点研究,但仅通过酶学研究低温微生物的机理有局限性,细胞膜在低温下流动性的保持以及低温下的新陈代谢也是低温适应性机理中非常重要的部分。胞内物,包括胁迫蛋白、抗冻6蛋白、小分子化合物等的研究,也证明了微生物的耐冷性更趋向于全细胞的适应,而不是单纯某类分子的特性改变。嗜冷酶在低温下具有较高的催化效率kcat/K,从结构方面讲,嗜冷酶的低温下活性主要得益于其分子组成特点引起的空间高柔韧性结构(flexibility),或者说是由其热不稳定性引起酶分子的高柔韧性结构使酶具有较高的底物结合能力从而降低Km,但高柔韧性结构同样也引起酶的耐热性降低。嗜冷、嗜温和嗜热微生物中的谷氨酰脂脱氢酶（glutamatedehydrogenase）、β-内酰胺酶（β-lactamases）和α-淀粉酶(α-amylase)等酶的氨基酸组成表明,嗜冷酶具有较少的脯氨酸和精氨酸,较低的脯氨酸与赖氨酸比,较少的二硫键。嗜冷、嗜温和嗜热3种DNA连接酶的三维模型分析显示,其表面疏水残基含量依次降低(22%、18%、17%),亲水残基含量依次升高(69%、75%、77%),中性氨基酸含量依次降低(21%、18%、14%);同时,低温连接酶活性位点的表面可接触中性残基含量(20%)也高于其他两种连接酶(18%、9%),表明嗜冷酶氨基酸残基组成对酶的活性、柔韧性和耐热性具有综合影响。另外,其他研究表明减少盐桥、离子键、芳香环相互作用,减弱结构域的相互作用、增加表面环状结构(surfaceloops)也可以提高酶的柔韧性并降低其耐热性。利用定点突变等手段改造中温、嗜热酶,使其具有类似于低温的特性证明了氨基酸组成对酶的低温活性具有重要影响,也为生产广适应温度蛋白酶奠定了基础。Tindbaek等人通过定点改造,切除了中温枯草杆菌蛋白酶（savinase,EC3.4.21.62）活性中心中的12个氨基酸残基（LSLGSPSPSATL）,并插入人工合成的低温枯草杆菌蛋白酶S39的一段同源高柔韧性性区域（MSLGSSGESSLI）,获得一种新的蛋白酶H5。该酶在低温下H5具有更高的催化活性与分子柔韧性,而其热稳定性也高于低温枯草杆菌蛋白酶S39,而其最适催化温度及pH值与出发酶savinase相同。氨基酸组成与结构对比并不能完全解释嗜冷酶的机制。如从南极分离出一株Arthrobacter属低温菌,其β-半乳糖苷酶在18℃具有最大活性,在0℃仍有50%活性,与另一种40℃最大活性的β-半乳糖苷酶比较,除了脯氨酸残基比较少外,上述嗜冷酶的其他特点都未发现,进一步研究表明,该酶在低温下是一种四聚体结构,在25℃的时候分解为无活性的单体,说明该酶的低耐热性与其四级结构有7关。目前对低温微生物的应用正处于起步阶段,并多为嗜冷酶的利用,但其他方面的研究也在逐步进展中,如膳食不饱和脂肪酸、作为防冻保护剂的抗冻蛋白、食品发酵中的低温酵母等。在环境治理领域,利用低温微生物可以在冬季等低温环境下保持较高代谢活性的优势,一些环境治理的新方法也得以实现,如固定化培养耐冷隐球酵母（Cryptococcussp.）和红酵母（Rhodotorulasp.）降解工业苯酚等。另外,古细菌作为一种新兴的生物资源,广泛分布于高寒地带,而开发和利用古细菌资源包括其表达的酶、蛋白质、脂类等物质已经成为近年研究的热点。第四章蛋白酶的检测方法蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解底物酪素产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计测定，计算其酶活力。1.试剂和溶液1mol/L及0.1mol/L盐酸(HCl)溶液、100mg/mlL－酪氨酸标准液、0.4mol/L碳酸钠(Na2CO3)溶液、福林(Folin)试剂、乳酸缓冲液、1.0%酪素溶液、0.4mol/L三氯乙酸(CCl3—COOH)溶液2.仪器和设备2.1恒温水浴锅。2.2分光光度计有10mm比色皿，可在660nm处测量吸光度。3测定步骤3.1标准曲线绘制分别吸取100mg/mlL－酪氨酸标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，制成每ml分别含L－酪氨酸0、10、20、30、40、50、60mg的稀标准液。各取上述溶液1.00ml（须做平行试验）于试管中，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml，稀福林试剂1.00ml，置于40℃水浴中显色20min，取出用10mm比色皿，在波长660nm处用分光光度计分别测定其吸光度，其中不含酪氨酸的管为空白对照。以吸光度为纵坐标，相应的酪氨酸8浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。当吸光度为1时的酪氨酸量(mg)即为比色常数K值。3.2待测酶液的制备3.3比色测定精确吸取待测酶液1.0ml(每个样品3支平行试管)，40℃水浴预热2min。同时取适量1%酪素溶液在40℃水浴预热3～5min，然后取其1.0ml，加入到经预热的上述酶液中，立即开始计时，于40℃水浴精确反应10min，立即加入2.0ml0.4mol/L三氯乙酸，摇匀，取出静置10min，过滤，取滤液1.0ml。加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.0ml，以后按标准曲线绘制步骤测定样品吸光度。同时进行空白对照测定，其步骤为吸取待测酶液1.0ml，40℃水浴2min后加入2.0ml0.4mol/L