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1Bt几丁质酶的研究进展魏潇2009221107100070湖北大学生命科学学院2009级生物工程0前言几丁质酶是催化几丁质水解生成N-乙酰葡糖胺反应的酶。几丁质酶在生物防治方面有两大用途：其一可以防止真菌病害。因为除卵菌外所有真菌的细胞壁都含有几丁质，通过水解细胞壁的几丁质可有效地抑制真菌的生长。其二，对杀虫剂有增效作用。苏云金芽孢杆菌（简称Bt）商品制剂，作为最重要的生物杀虫剂，已成功用于多种农、林、果蔬和卫生害虫的防治，且在减少化学杀虫剂的污染和植物保护中起到了重要作用。许多学者致力于Bt几丁质酶的研究，其目的是为了扩大Bt制剂的作用范围，进一步提高杀虫活性。近几年来，关于几丁质酶在苏云金芽孢杆菌中的分布、酶的产生条件、酶的性质与结构、Bt几丁质酶基因的克隆、几丁质酶在生物防治中的作用等方面的研究逐渐增加。本文对几丁质酶产生生物、酶的性质、酶的种类、酶活的测定方法以及上述内容作一综述，以期为苏云金芽孢杆菌几丁质酶的突变及其酶学性质研究提供参考。1几丁质酶的来源能产生几丁质酶的生物很多，包括植物，动物和微生物。几丁质酶最初从兰花球茎中发现，目前在绝大多数高等植物中都或多或少地发现了这种酶，可存在于根、茎、叶、种子及愈伤组织中，特别是当它们受到真菌感染的时候．1929年Karrer和Hoffman从蜗牛中也分离到几丁质酶，后来又从昆虫体内、人的唾液、猪的器官中发现了这种酶。从微生物中分离筛选几丁质酶产生菌的报道最近越来越多，海洋中由于积聚有较多的几丁质，因此能利用它的微生物也较多，成为人们筛选的首选目标。Cottrell认为至少10％的海洋可培养细菌能水解几丁质，Wang等认为有25％～50％的土壤链霉菌能产几丁质酶，真菌产几丁质酶的报道也不少。Cody曾对土壤中几丁质酶产生菌进行过筛选，分离到了39属共72种细菌和一种假丝酵母(Candidaalbicans)。最近Hiramatsu还发现一些病毒如Chlorellavirus也能产生几丁质酶，这样把几丁质酶产生生物扩展到几乎整个生物界。2几丁质酶的特性2由于几丁质酶是一类复合酶，有多种蛋白组成，各种蛋白的性质有其自身的特点．几丁质酶的分子质量一般在20～120ku之间，其中细菌的几丁质酶多为60～110ku，放线菌的多为30ku或更低，真菌的一般大于30ku，植物几丁质酶也在30ku左右，昆虫几丁质酶的分子量较大，一般大于5Oku。大多数细菌性几丁质酶有酸性的等电点，放线菌的一般为中性或碱性，而植物的几丁质酶往往有非常酸性或非常碱性的pI．大多数细菌性几丁质酶的最适pH为酸性或碱性，而放线菌和真菌的最适pH常是酸性的。关于几丁质酶的热稳定性，一般在6O℃以下稳定，但地衣芽孢杆菌的几丁质酶在IO0℃处理10min后仍有一半多活性．WangSL发现一种假单胞菌PseudomonasaeruginosaK-187的胞外几丁酶F2有与地衣芽孢杆菌几丁质酶相似的热稳定性。值得注意的是近来Tanaka从嗜高热古细菌PCOCCUSkodakaraensisKOD1中分离到了抗热性很强的几丁质降解酶，ChiA的最适作用温度是85℃，在100％处理3min后失活，但其缺失C端的同系物ChiA△2耐热性很强，在100℃处理3h后仍保留70％的酶活力，这极大地拓展了几丁质酶的应用范围。3几丁质酶的种类关于几丁质酶这一概念目前用得比较混乱，广义的几丁质酶是指所有与几丁质降解有关的酶，还包括脱乙酰酶，壳聚糖酶，几丁寡糖酶，几丁二糖酶等，狭义的几丁质酶是指催化水解至少含有一个N．乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶，包括几丁内切酶和几丁外切酶。几丁质酶根据其氨基酸序列特征可分成6类，I、Ⅱ、Ⅳ型归于糖基化水解酶的第19族，主要存在于植物中，Ⅲ、V型归于第18族，广泛存在于病毒、细菌、真菌、昆虫、节肢动物、植物和哺乳动物中。绝大多数的细菌性几丁质酶属于第18家族，其主要功能是分解周围环境中的几丁质，以满足其自身对营养的需求，而对真菌的抑制能力较弱或无；这些酶具有多个功能区域，如催化部位、几丁结合部位、纤维连接蛋白(fibronectin)Ⅲ区域及钙粘蛋白(cadhefin)区域，但各区域的功能尚未被明确阐明。4酶活的测定方法几丁质酶活力一般采用几丁质被水解后形成的还原糖含量的多少来定量．具体测定方法很多，如用DNS法测还原糖，或用Schales法测释放3的氨基糖，或用人工合成的对硝基苯．N．乙酰几丁寡糖作基质来测定释放的对硝基苯含量，也有用3H标记的几丁质作底物来测定释放的放射活性。曾采用一种新的简便的还原糖测定方法，即用斐林试剂反滴定法，结果证明不但灵敏度高，重复性好，而且由于斐林滴定法在沸腾的条件下进行，因此可省却煮沸酶液以终止反应这一步骤，因而更加快速简便。5Bt几丁质酶及其基因的分布筛选几丁质酶菌株最常用的方法是制备以胶体几丁质为唯一碳源的琼脂平板，通过观察水解圈的有无及大小，初步确定菌株分解几丁质的能力。但是，有些学者认为平板筛选方法有很大局限性。因为几丁质酶在其性质、酶的反应条件及其能否分泌到胞外等方面存在差异。而特异引物PCR方法也可能因为不同几丁质酶基因中引物匹配度的原因造成一些漏检，或者检出沉默基因。因此，有学者认为，对于研究Bt菌株几丁质酶的分布情况。需要利用平板筛选和PCR检测的复合方法。和其他产几丁质酶的微生物一样，Bt几丁质酶通常也认为是诱导酶，一般认为几丁质或除几丁质单糖以外的几丁质水解产物都可以作为诱导物。而碳氮源，pH、温度等培养条件则一般认为与Bt的最佳培养条件相同。在目前的研究中，多生产几丁质酶的Bt菌株都是在有诱导物的平板上筛选出来的，这些菌株在没有诱导物存在的情况下是否能够合成几丁质酶，目前尚无这方面的研究结果。6Bt几丁质酶的理化性质Bt几丁质酶作用的最适温度是60℃左右，最适的pH偏中性，与大多数细菌几丁质酶最适pH3.0～11.0之间相符。由于昆虫中肠的碱性环境，人们通常认为相比酸性和中性几丁质酶，碱性几丁质酶对杀虫增效作用可能更为明显。7Bt几丁质酶基因和酶的分子生物学研究7.1Bt几丁质酶基因及其核算序列特点目前GenBank中已经收录几丁质酶基因序列的Bt的9个亚种11个菌株，其中8个序列为我国学者提供。4已克隆几丁质酶基因的苏云金芽抱杆菌亚种、血清型及其基因大小表中大部分的Bt几丁质酶基因的ORF是2031bp或2067bp，只有两个不同，分别为Btpakistani的1908bp和另外一个的2025bp。上述几丁质酶基因序列的同源性很高。通过比较发现，Btkurstaki的chi255、Btpakistani的chiA71和Btkenyae的chi74，都具有相同的SD序列（5′GAAGG′3），且它们启动子的保守序列完全相同。并且有学者通过几丁质酶合成曲线，证明Bt几丁质酶的产生是从营养期开始与芽孢的形成无关。7.2Bt几丁质酶的氨基酸序列Bt几丁质酶分为三个区域，从N端开始依次分别为：几丁质酶催化区，粘蛋白III型同源区（FLDs）和几丁质结合区（CBD）。Bt几丁质酶通常为胞外酶，因此几丁质酶的N端部分都有信号肽。信号肽与几丁质酶分泌有关。催化区域是几丁质酶水解几丁质的区域，Bt几丁质酶的催化区域和糖水解酶18家族的典型活性基序列同源，且Bt不同菌株之间几丁质酶催化区域的同源性很高。FLDs区域在降解不同类型的不可容多聚物的酶中发现，如细菌的几丁质酶、纤维素酶和淀粉酶，FLDs可能和酶与底物的结合有关，在FLDs中，典型的芳香族氨基酸是非常保守的，Bt几丁质酶的FLDs同源性也很高。Bt几丁质酶的结合域高度保守，特别是芳香族氨基酸，并且在木聚糖酶、纤维素酶的相应区域都存在，CBD对于酶结合底物起到重要作用，也有一些几丁质酶的这个区域参与底物的水解。5并非所有的Bt几丁质酶都有通常的3个结构域，FLDs和CBD并不是水解几丁质所必需的，这种情况在其他微生物的几丁质酶中也存在。8Bt几丁质酶在杀虫增效和抑制真菌方面的应用1998年英国学者率先用BtisraelensisIPS78和BtaizewaiHD133两菌株所产生的几丁质酶对蚊幼和海灰翅夜蛾的杀虫增效作用分别进行了研究。实验运用了一种特异的几丁质酶抑制剂阿洛氨菌素，在生测系统中通过对比试验证明几丁质酶在杀虫活性上的增效作用。随后有多组学者分别证明了Bt几丁质酶对小菜蛾、埃及伊蚊的杀虫增效作用。Arora等在大肠杆菌中克隆了HD-1的几丁质酶基因，发现表达的几丁质酶能够增效Bt的营养期杀虫蛋白对斜纹夜蛾幼虫的毒力。Bt几丁质酶抑制真菌研究目前处于初始阶段。Moar等诱变BtHD-548后筛选出一株高产几丁质酶、广谱抑制真菌的突变菌株，后来，Driss等人也发现产几丁质酶菌株Btkurstaki的发酵上清，对黑曲霉有很强的抑制作用。有报道称绝大多数的细菌性几丁质酶属于糖水解酶18家族，其主要作用是分解周围环境中的几丁质以满足其自身对营养的需求，而对真菌的抑制作用较弱或无。无论杀虫还是抑真菌实验，多数的研究均采用粗几丁质酶或发酵的上清液，因此有些学者认为，这些杀虫和抑真菌的作用也不能排除粗酶和培养液中的其他活性成分所起的作用。9结束语目前虽然对几丁质酶及其基因的研究报道较多，但由于几丁质酶的多样性，其调控机理的复杂性，再加上从自然界中分离到的酶活性不是太高，因此离工业应用的要求还相距甚远。今后应在生理上进一步加强诱导与阻遏的研究，在遗传上用定向突变技术搞清酶的催化与结合等效应部位，搞清操纵子的结构及特性，通过原生质体融合技术来增加几丁质酶的产量，通过基因克隆技术将几丁质酶转移到高效表达载体上。另外，昆虫致病真菌能产几丁质酶溶解昆虫体壁上的几丁质，而植物又能分泌几丁质酶溶解致病真菌细胞壁上的几丁质，那么昆虫和植物致病真菌体壁上的几丁质到底有什么不同，昆虫致病真菌的细胞壁上应该也有部分几丁质，这些几丁质为什么能抵抗自身产生的几丁质酶，而植物致病真菌为什么容易受植物产生的几丁质酶的攻击?从分子水平上对几丁质及几丁质酶性质的阐明将有助于回答这些问题。6Bt几丁质酶的研究与应用处于初始阶段，缺少具有深入和系统的研究结论。目前在研究中要注意的问题有以下几个方面。首先，需要筛选高产的几丁质酶的Bt菌株。在已报道的Bt菌株中，其几丁质酶的活性与其他芽孢杆菌相比并不是很高。另外需要加强Bt几丁质酶杀虫增效及抑制真菌方面的研究，进一步明确几丁质酶的作用。其次，要对Bt几丁质酶的表达方式进行研究，已确定其是诱导型酶还是组成型酶，以及Bt几丁质酶的合成是否与传统Bt发酵工艺相吻合。总之，苏云金芽孢杆菌几丁质酶的应用基础研究还需要更加系统和深入。参考文献[1]陈少波，吴根福.科技通报，2004,20（3）：258～262.[2]卢伟，蔡峻，陈月华.微生物学通报，2007,34（1）：143～147.[3]郑爱萍，李平.中国生物工程杂志，2002,40:75～79.[4]邱立友，王明道，戚元成,等.微生物学通报，2006,33（2）：58～62.[5]DrissF,Kallassy-AwadM,ZouariN,etal.JournalofInvertebratePathology,2000,76:270～277.[6]林毅，关雄.生物技术，2004,14（3）：1～2.[7]AroraN,AhmadT,RajagopalR,etal.BiochemicalandBiophysicalCommunications,2003,307:620～625.[8]孙胜利，喻子牛，贾新成.微生物学杂志，2002，22（5）：47～50.[9]钟万芳，姜丽华，阎文昭，等.遗传学报，2003,30（4）：364～369.[10]ThamthiankulS,Suan-NgayS,PanbangredW.ApplMicrobiolBiotechnol,2001,56；395～401.