羊肚菌多糖的初级分离纯化

青海民族大学毕业论文1羊肚菌多糖的初级分离纯化摘要摘要:目的研究羊肚菌多糖的分离纯化。方法通过超声水提醇沉的方法提取其多糖，经水提得到的羊肚菌粗多糖通过脱色，Sevage法进行脱蛋白，经DEAE-52离子交换柱层析，用纯水、0.1、0.3、0.5、0.7mol·L-1NaCl溶液和0.1、0.3、0.5mol·L-1NaOH溶液进行阶段洗脱。结果得到六种组分TAP-1、TAP-2、TAP-3、TAP-4、TAP-5、TAP-6，其得率分别是24.56%、18.72%、2.32%、15.08%、6.57%、2.48%。结论得到不同的多糖，其中中性多糖占上样量的24.56%，酸性多糖占上样量的42.69%，碱性多糖占上样量的2.48%。关键词：羊肚菌；多糖；分离纯化羊肚菌中多糖的分离纯化2AbstractAbstract:ObjectiveTostudytheisolationandpurificationofPolysaccharidesfrommorchella.Methodbyultrasonicwaterprovidedalcoholprecipitationmethodforextractionofthepolysaccharide,withwaterprovidedfromMorchellapolysaccharidebydecoloration,SevagemethodofremovingproteinandbyDEAE-52ionexchangechromatography,thepurewater,0.1,0.3,0.5,0.7mol-L-1NaClsolutionand0.1,0.3,0.5mol-L-1NaOHsolutionphaseelution.ResultssixcomponentsTAP-1,TAP-2,TAP-3,TAP-4,TAP-5,TAP-6,theyieldwas24.56%,18.72%,2.32%,15.08%,6.57%,2.48%,,respectively.Conclusionpolysaccharidefromdifferent,whichaccountedfor24.56%oftheamountofneutralpolysaccharides,acidicpolysaccharidesaccountedfor42.69%ofthesample,theamountofalkalinepolysaccharideaccountedfor2.48%.Keywords:Morchellaessulenta;polysaccharide;separationandpurification青海民族大学毕业论文3目录引言...........................................................11材料与设备...................................................11.1材料与试剂..............................................11.2仪器....................................................12方法.........................................................22.1羊肚菌实体多糖的提取....................................22.2羊肚菌多糖的脱色........................................22.3羊肚菌多糖的醇沉........................................22.4羊肚菌多糖的脱蛋白......................................22.5羊肚菌多糖的离子交换柱层析..............................22.6离子交换柱的后处理......................................33实验结果与讨论...............................................33.1结果....................................................33.2讨论....................................................44结论.........................................................4参考文献.......................................................5致谢...........................................................6青海民族大学毕业论文6引言羊肚菌(Morchellaesculenta)隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属(Morchella),因其菌盖表面呈许多小凹坑,外观极似羊肚而得名[1]。羊肚菌是一种野生名贵食药用真菌,最早收录于李时珍的本草纲目。中医认为其性平,味甘寒,无毒,具有益肠胃、消化助食、化痰理气、补肾、壮阳、补脑、提神之功能[2]。现代研究发现,羊肚菌具有很高的营养和药用价值,特别是羊肚菌多糖有降血脂、调节免疫功能、抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤等作用,并能减轻癌症患者放化疗引起的毒副作用[3]。对多糖的分离提纯，国内外常采用有机溶剂沉淀法和柱层析分离法。本文通过超声，超速离心，有机溶剂沉淀、离子交换柱层析的的方法对羊肚菌多糖进行了分离提纯。1材料与设备1.1材料与试剂羊肚菌2015年5月采于青海省互助北山林场，经卢教授鉴定为正品；苯酚（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；浓硫酸（分析纯，白银良友化学试剂有限公司）；氯化钠（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；氢氧化钠（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；浓盐酸（分析纯，白银良友化学试剂有限公司）；95%乙醇（分析纯，天津市白银良友化学试剂有限公司）；正丁醇（分析纯，天津市富宇精细化工化学有限公司）；三氯甲烷（分析纯，天津市富宇精细化工化学有限公司），DEAE-52（分析纯，北京满仓科技有限公司）；火棉胶（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）。1.2仪器AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；FZ102粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）；TD3低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DHG-9140B电热恒温鼓风干燥箱（上海琅玕仪器设备有限公司）；R-215旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；HSB-3循环水式真空泵（郑州杜仪器厂）；T6新悦紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；DBS-100自动部分收集器（上海沪西仪器厂）；FOU-1100冷冻干燥器(上海爱朗仪器有限公司)。羊肚菌中多糖的分离纯化22方法2.1羊肚菌实体多糖的提取羊肚菌干品粉碎过20目筛，称取1000g，超声提取，超声功率80W，提取时间1h，料液比2:1，提取2次，提取羊肚菌多糖，趁热用纱布过滤并收集滤液，滤液于4000rpm离心15min，离心后合并上清液，并用旋转蒸发仪浓缩至总体积约200mL[4]。2.2羊肚菌多糖的脱色D354FD树脂预处理:取一定体积的树脂，先用5～10倍体积的蒸馏水浸泡，并使用蒸馏水反复冲洗，去除机械杂质和破碎的树脂细粒，纱布过滤后树脂用5%HCl溶液浸泡3h，后用蒸馏水反复洗涤至中性，再用5%NaOH溶液浸泡3h，再用蒸馏水洗涤至流出水为中性[5]。按照体积比1:1往多糖浓缩液中添加经过预处理的D354FD树脂，放置50℃水浴锅中水浴3h，并间隔搅拌，然后抽滤除去树脂，并用少量水洗涤树脂，合并洗涤液即为经过脱色的多糖溶液[6]。2.3羊肚菌多糖的醇沉往脱色后的多糖溶液中缓慢添加4倍95%乙醇，同时不断搅拌，至使多糖均匀沉淀，添加乙醇至混合液中乙醇浓度为70%，置4℃冰箱中放置16h。之后将糖醇混合液转移至离心管，4000r/min离心15min，弃去上清液，沉淀于50℃烘箱烘干，得羊肚菌粗多糖干品。2.4羊肚菌多糖的脱蛋白Sevag试剂的配制:取三氯甲烷和正丁醇，以5:1体积比进行混合，放置棕色瓶中备用[7]。Sevag法脱蛋白，取一定量的羊肚菌粗多糖干品，添加适量蒸馏水溶解混匀，糖溶液和Sevag试剂按照4:1的体积进行混匀，搅拌20min，转入离心管，4000r/min离心10min。混合液分为三层，其中上层为多糖溶液，弃去中间层变性蛋白和下层有机溶剂，重复操作15次。往脱蛋白后的多糖溶液中添加4倍95%乙醇按照2.3步骤进行醇沉，醇沉离心后于50℃鼓风干燥箱中烘干，最终得到羊肚菌粗多糖干品（TAP）备用[8-9]。2.5羊肚菌多糖的离子交换柱层析DEAE-52的预处理：取40gDEAE-52，用5～10倍蒸馏水浸泡溶胀，于4℃青海民族大学毕业论文6冰箱中放置过夜。然后小心倾倒上层水分，同样用5～10倍0.5mol·L-1HCl溶液浸泡1h，过滤弃去溶液并用蒸馏水反复洗涤至中性，然后添加0.5mol·L-1NaOH溶液浸泡并用蒸馏水洗涤至中性[10]。经过处理的DEAE-52装入2.6ⅹ20cm层析柱中，装的过程中避免产生气泡使填料柱不均匀，用恒流泵泵送蒸馏水洗脱，调整使其平衡使最后流速为0.5mL/min，流速稳定后用蒸馏水洗脱24h[11]。称取羊肚菌粗多糖干品（TAP）300mg，加蒸馏水溶液配制成10mg·mL-1的粗多糖溶液，经过离子交换柱层析，依次用蒸馏水、0.1、0.3、0.5、0.7mol·L-1NaCl溶液和0.1、0.3、0.5mol·L-1NaOH溶液洗脱，10min/管，自动收集器收集，苯酚-硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线并按峰收集[12]。将收集到的羊肚菌多糖溶液分别浓缩至小体积，流水透析24h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥，得到初步纯化的6个部分羊肚菌多糖TAP-1、TAP-2、TAP-3、TAP-4、TAP-5、TAP-6，计算各部分多糖得率，计算公式：多糖得率=各级多糖质量/上样多糖质量×100%2.6离子交换柱的后处理用0.7mol·L-1NaCl洗脱以后，直接用1mol·L-1NaCl洗脱2-3个体积，然后用蒸馏水洗脱至中性，再用1mol·L-1HCl洗脱2-3个体积，最后用蒸馏水洗脱至中性，置于原来的容器，加入一定量的乙醇搅拌，等澄清后倒出乙醇，反复几次，水除去后，加少量乙醇，密封保存，待用。3实验结果与讨论3.1结果离子交换柱层析是以离子交换剂为固定相，不同的多糖有不同的分子大小和电荷排列方式，依据其与离子交换剂亲和力的不同，以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变离子强度或pH使多糖大分子再从离子交换剂上依次被洗脱下来。羊肚菌中多糖的分离纯化40.0000.5001.0001.5002.0002.5003.0003.5004.0004.500050100150200250吸光度洗脱管数图1羊肚菌实体多糖的离子交换柱层析洗脱曲线羊肚菌实体多糖的DEAE-52离子交换柱层析，采用不同浓度梯度的NaCl（0～1mol·L-1）溶液和NaOH（0～0.5mol·L-1）溶液对离子交换柱层析进行洗脱，同时苯酚-硫酸法跟踪检测各个组分多糖含量，结果见图1，得到六个组分，其中蒸馏水洗脱出第一个组分，记为TAP-1，含量占上样量的24.56%，0.1mol·L-1NaCl溶液洗脱得到第二和第三个组分，记为TAP-2和TAP-3，含量占上样量的18.72%和2.32，0.3mol·L-1NaCl溶液洗脱得第四个组分，含量占上样量的15.08%，0.5mol·L-1NaCl溶液洗脱得第五个组