Roche-LightCycler-480-中文操作说明

LightCycler®480中文操作说明罗氏医学仪器公司/应用科学部门February2008LightCycler480中文操作說明2目录一.启动机器与软件3二.软件设定---开启新实验5三.样品编辑9四.结果分析12五.报告18六.数据转移至其它计算机(数据输出与输入)19七.使用者管理19LightCycler480中文操作說明3一．启动机器与软件启动机器1.机器主开关位于机器右后方。2.机器正面两个警示灯代表机器状态。待警示灯(右)由闪烁橘色灯转变成稳定橘色灯，警示灯(左)由橘色转变成绿色(约三分半钟)，表示机器已经启动完成。左警示灯右警示灯机器状态橘*闪烁*橘*闪烁*正在初始化绿橘机器启动完成96/384孔盘还未放入绿橘*闪烁*96/384孔盘正在放入中绿绿机器启动完成96/384孔盘已经放入绿*闪烁*绿*闪烁*实验进行中LightCycler480中文操作說明43.按压机器正面上唯一的按钮，放入已经封膜完成之96或384孔盘。放置完成后，左右两警示灯都呈现绿色。启动软件1.开启计算机，并以正确的使用者名称与密码登入Windows。Username:OPERATORPassword:LC4802.开启LightCycler480软件，并输入正确的使用者与密码。LightCycler480中文操作說明5二．软件设定--开启新实验设定新实验1.软件开启后，会进入主画面。点选“NewExperiment”。2.出现实验设定窗口。任何时候需要回主画面的话，点选画面右边的按钮。LightCycler480中文操作說明6设定实验若要套用设定好的实验步骤(Template)，请跳至6.。1.在实验设定画面上方，先选择适当的DetectionFormat。选项包含:另外可再点选“Customize”勾选所需的滤片组合。2.输入反应体积:96wellplate范围为10-100ul，而384wellplate范围为5-20ul。LightCycler480中文操作說明73.设定实验步骤(Program)设定program，包含有Pre-incubation,Amplification(PCR),Meltingcurve(optional)与Cooling。利用『+』与『－』增加或删除步骤。设定循环数目(Cycle)与分析模式。通常Amplification(PCR)program设定成『Quantification』，而MeltingCurveprogram设定成『MeltingCurve』。4.设定详细温度变化(依照不同实验方法与设计而有所不同)点选各个program即可设定详细温度变化步骤，请根据产品说明书来设定，利用『+』与『－』增加或删除步骤。需要设定的参数包含Target(℃)目标温度，AcquisitionMode(荧光侦测模式)，Hold(hh:mm:ss)停留时间。RampRate(℃/s)为升降温速度，范围如下：RampRate(℃/s)HeatingupCoolingdown96-wellBlock1.0–4.4℃/s1.0–2.2℃/s384-wellBlock1.0–4.8℃/s1.0–2.5℃/s若设定温度低于50℃，请把RampRate调整成1.5℃/s(96well)或2.0℃/s(384well)。LightCycler480中文操作說明85.将实验步骤储存成『Template』以便下次进行套用。点选左下角“SaveAsTemplate”即可把此步骤储存起来。6.若要进行套用时，请直接点选窗口左下角“ApplyTemplate”，选择欲套用之实验步骤即可。7.设定完成后点选“StartRun”开始进行实验。8.跳出档案储存窗口，请输入欲储存之文件名称。实验进行中会进入另一个Data窗口，窗口下方按键功能如下：EndProgram:结束此Program,进入下一个Program。+10Cycles:实时增加循环数目。AbortRun:马上结束此实验，请注意，若按此键，则此次实验的结果将不储存。LightCycler480中文操作說明9三．样品编辑将样品分群1.点选窗口左边的“SubsetEditor”。2.点选“New”新增新的群组，并将其命名。3.利用鼠标选取此群组之样品位置，点选窗口右下角“Apply”，此时被选取的样品位置会呈现实心的蓝色，如下图。4.以此方式依序将所有样品群组编辑完毕。样品必须分群才能够独立分析，但是样品是否分群并不影响样品的Cp值。LightCycler480中文操作說明10编辑样品名称1.点选窗口左边的“SampleEditor”。2.输入每个位置之样品名称(Name)与重复(Repl.Of)。3.若要更快速输入，可直接在左边的图上点选欲编辑之样品：若A1,A2与A3为三重复，在A2与A3Repl.Of字段上都填上A1即为三重复。在编辑过程中，可利用『Ctrl』+『C』复制文字，『Ctrl』+『V』贴上文字。LightCycler480中文操作說明114.根据实验分析模式，编辑AbsQuant(绝对定量)，RelQuant(相对定量)，或Genotyping分页，设定SampleType。绝对定量(AbsQuant)：『Unknown』:未知浓度样品『Standard』:已知浓度标准品相对定量(RelQuant)：『Target』:目标基因『Reference』:参考基因『Calibrator』:Control样品『Standard』:已知浓度的样品『Unknown』:未知浓度样品其它分析模式之分页在此不赘述，请自行参考LightCycler480InstrumentOperator’sManual。5.若设定成『Standard』之样品请输入浓度。6.若想要将此样品编辑储存成Template，可点选窗口左下角“SaveAsTemplate”即可，下次实验时可点选“ApplyTemplate”进行套用。LightCycler480中文操作說明12四．结果分析点选左边的“Analysis”，选取分析模式，并选择所需分析之群组，如下图：分析模式说明AbsQuant/2ndDerivativeMax绝对定量(自动法)AbsQuant/FitPoints绝对定量(手动法)ColorCompensation色差校正(多色实验校正用)GeneScanning基因扫描(适用于HighResolutionMeltingCurve,HRM分析)Genotyping基因分型(适用于HybProbe之基因分型实验)RelativeQuantification相对定量TmCallingTm分析1.2.3.LightCycler480中文操作說明13绝对定量(AbsoluteQuantification)1.点选下方的“Calculate”即可得到样品之Cp与标准曲线。2.数值之数据输出:在数值分析表上按鼠标右键，点选“Export”即可输出成.txt档案格式。可直接以MicrosoftExcel软件开启。3.图形输出:在图形上按鼠标右键，点选“Export”即可输出成各种图形档案格式。4.标准曲线储存:点选窗口下方StdCurve之“Saveasexternal”，输入适合档名后即可储存在数据库中。各個樣品之Cp值與濃度重複樣品平均後之Cp值與濃度,並自動計算標準差LightCycler480中文操作說明14相对定量(RelativeQuantification)1.在选择相对定量分析后，出现下面窗口：ReferenceSampleLocation:若Reference(Housekeepinggene)之样品在同一盘上请选择“In-Run”，否则请选择“External”可输入另一次实验的数据一起分析。建议将AutoPair打勾让计算机自动将样品配对。2.进入『Target』与『Reference』分页，右下角显示“Eff=2”表示将目标基因与参考基因的PCR效率以2.0来计算。3.若需要校正目标基因与参考基因之PCR效率，则需要输入标准曲线。在『Target』与『Reference』分页之右下角，输入(import)标准曲线。LightCycler480中文操作說明15Useinrun：输入(import)同一盘上之标准曲线。Useexternal：输入(import)之前已储存于数据库中之标准曲线。4.点选『Pairing』分页，检查计算机自动配对结果是否正确。其中，红色表示Unknown样品，绿色表示Calibrator样品。若欲外加配对，则可直接以鼠标点选样品后按“Add”即可增加配对。5.点选『Results』分页，点选“Calculate”即可得到计算结果。6.数值和图形输出与绝对定量相同。(请参考绝对定量)LightCycler480中文操作說明16基因分型(Genotyping)1.进入基因分型的窗口中。2.窗口右下角可设定分类方式AutoGroup：自动分组In-run：标准品包含在本次实验中External：标准品在之前已储存之实验中3.点选“Calculate”即可得到分型结果。LightCycler480中文操作說明17Tm分析(TmCalling)1.进入Tm分析窗口2.确认波峰数目3.选择检测模式4.点选“Calculate＂即可得到每个样品之Tm值。LightCycler480中文操作說明18五．报告(Report)1.将分析后结果储存后即可点选报告键。数据储存报告2.勾选想要呈现的报告内容。3.点选“Generate”即可产生报告。4.点选“PDF”即可将此报告储存成.pdf档案格式。LightCycler480中文操作說明19六．数据转移至其它计算机(数据输出与输入)数据输出1.点选(navigator)2.点选所要输出的实验档案，点选即可将档案输出成.ixo档案3.将此ixo档案以光盘或随身碟存到另一计算机数据输入1.分析计算机上开启LightCycler480软件，登入后点选2.点选，选取所要输入的.ixo档案并开启，即可开始进行实验数据分析3.点选将此实验档案储存至数据库中七．使用者管理1.点选右方工具键。2.点选“UserandGroups”。3.点选“New”即可新增使用者，并设定使用者名称、密码与权限。