贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍

流式细胞仪FLOWCYTOMETER原理及软件介绍BeckmanCoulter流式细胞仪发展史1947年WallaceCoulter发明了库尔特原理，用于血细胞分析1953年推出了世界上第一台流式细胞分析仪CoulterCounterModelA1972年推出世界上第一台激光流式细胞仪EPICSII1975年研制出世界上第一台带计算机的流式细胞仪1997年推出世界上第一台单激光四色数字化流式细胞仪EPICSXL/MCL2000年首先将高精度数字化颜色补偿技术ADC（AdvancedDigitalCompensation）应用于流式平台，引领流式进入全新的全矩阵补偿、全自动补偿和脱机补偿时代2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细胞仪FC500/MCL，2005年升级为FC500/MPL2006年推出世界上第一台具有EV参数同时进行无成本绝对计数的多功能细胞分析系统QuantaSC，将流式细胞术与库尔特原理完美结合，2007年推出MPL进样系统2007年收购Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成为高端流式市场的领导者2009年，推出世界是第一台三激光十色的分析型流式细胞仪Gallios/NaviosEPICSXL-ADCQUANTASCCytomicsFC500BeckmanCoulterCelllabFamilyMoFloXDPGallios/NaviosCyanADPFC500硬件Whatisflowcytometry?流式细胞术是单个细胞/颗粒流过检测装置过程中，检测到的物理和/或化学的特性。HowardShapiro,PracticalFlowCytometry,3rdEdition分类分析型：只能分析用，液流进入废液筒分选型：回收目标细胞，用于后续实验。要求管道绝对无菌。基本原理流路（液流系统）流动室鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5*105~1*106个/ml光路（光学系统）光源滤片光电倍增管PMTHV电路（电路系统）放大电路HV及GAIN增益A/D转换分析系统：计算机流路构造流路单细胞悬液大多数仪器是在50-300µm大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中这一过程,成为流体动力学聚焦FLOWCELLInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid光路构造光路光源检测信号散射光信号FS:前向角散射光SS:侧向角散射光(90度散射光)荧光信号荧光染料光学滤片光路光源与通过的细胞聚焦在同一点上激光空冷488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,空冷/水冷EnterpriseII水冷Innova300系列Innova70系列常用激光器及其通道分配表检测信号散射光信号—前向散射光(FS)FS----Forward(AngelLight)Scatter在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测器FS的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及opticalhomogeneity有关FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性如:大小FALSSensorLaser前向散射光前向散射光散射光信号–侧向散射光SS-Side(AngelLight)Scatter与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也称为90度散射光检测器SS用于检测细胞内部结构如:胞浆内颗粒多少,核质比FALSSensor90LSSensorLaser侧向散射光侧向散射光90DegreeScatter02004006008001000ForwardScatter02004006008001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionForwardScatterProjectionLightScatterGatingScale光路-荧光信号每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号荧光染料的特性•激发波长(EXCITING)•发射波长(EMISSION)常用荧光染料的特性荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECy7488755免疫荧光深红PerCP488670APC6336705ColorSingleLaser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7荧光染料比较(平均荧光强度)Q-Prep/ImmunoPrep试剂系统PerCPAPCFITCECDPC5PECD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APCFreqFluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)光路-滤片特性长通滤片–允许长于设定波长的光通过短通滤片–允许短于设定波长的光通过带通滤片–允许一定带宽的波长通过光路-滤片特性当以45o角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光这种方式的滤片称为二向色性滤片(dichroicfilter)滤片带通滤片BANDPASS(BP)只允许某些波长的光通过二向色性滤片DICHROICFILTER一定波长以上通过，该波长以下折射630nmBandPassFilterTransmittedLightWhiteLightSource620-640nmLightDichroicFilter/Mirrorat45degReflectedlightTransmittedLightLightSourceOptics-DetectorsPhotomultipliertube(PMT)将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程LogFITC1000100101110.1Count30700150ImmunophenotypingImmunophenotypingSingleParameterHistogram:CountvsMFISingleParameterHistogramDualParameterHistogramsDualParameterHistograms分析系统以FC500机型的CXP软件介绍