羧肽酶研究进展

羧肽酶研究进展摘要：羧肽酶（Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）是一类可水解肽链Ｃ末端氨基酸残基的蛋白酶，广泛存在于高等植物、动物组织及真菌中，主要分为丝氨酸羧肽酶、金属羧肽酶和半胱氨酸羧肽酶３个亚类。本文综述了羧肽酶的研究进展，主要包括羧肽酶的应用、性质、来源分布、克隆表达及研究意义，并对其研究前景进行了展望。关键词：羧肽酶；应用；来源分布；性质羧肽酶是一种专一性地从肽链的Ｃ端逐个降解、释放游离氨基酸的一类肽链外切酶。在动物、植物的组织器官中，羧肽酶发挥着重要的生理功能，如胰腺羧肽酶Ａ和Ｂ可用于消化食物，羧肽酶Ｍ（ＣＰＭ）选择性地参与肽类激素的加工，羧肽酶Ｄ（ＣＰＤ）和羧肽酶Ｎ（ＣＰＮ）参与肽和蛋白质加工等。如表１所示，羧肽酶广泛应用于医药、食品等工业领域。在医药领域，由于羧肽酶广泛参与机体的生化反应，可通过体内羧肽酶的检测达到诊断和治疗疾病的目的；此外，在医药上还可用于体内不良物质（毒素等）的降解。在食品工业，可用于制备高Ｆ值寡肽、食品和饲料中赭曲霉素的去除、用作脱苦味剂等。在生物技术领域，羧肽酶可用于多肽的合成及多肽氨基酸序列测定，也可作为模式酶，对其他酶的研究提供帮助。动物来源的羧肽酶主要存在于猪、牛等的胰脏中，如羧肽酶Ａ／Ｂ，其数量非常有限、价格昂贵、导致其应用受到限制；微生物来源的羧肽酶存在于酵母、曲霉等真菌的液泡中，具有广阔的应用前景。因此，借助基因工程策略采用微生物为宿主大量生产重组羧肽酶，有望克服羧肽酶生产过程所遇到的动植物原料来源限制等限制，进一步降低生产成本、提高产品质量、深化酶学性质研究、扩展应用范围。本文综述了羧肽酶的种类、特点以及羧肽酶基因工程表达策略，主要包括羧肽酶的性质、来源分布、克隆表达，并对其研究前景和热点进行了展望。关键字：羧肽酶；应用；来源分布；性质一、羧肽酶的种类及其特点根据羧肽酶活性中心含有丝氨酸残基、金属离子和半胱氨酸残基的不同，将羧肽酶分，将羧肽酶分为丝氨酸羧肽酶（ＥＣ３．４．１６．－）、金属羧肽酶（ＥＣ３．４．１７．－）和半胱氨酸羧肽酶（ＥＣ３．４．１８．－）。１．１丝氨酸羧肽酶丝氨酸羧肽酶又称酸性羧肽酶，是一类真核生物蛋白水解酶，亚基相对分子质量４００００－７５０００，广泛存在于真菌、高等植物和动物组织中。在酸性环境，丝氨酸羧肽酶具有末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性，可同时参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解。由于位切点不同，丝氨酸羧肽酶又分溶酶体Ｐｒｏ－Ｘａａ羧肽酶（ＥＣ３．４．１６．２－ｌｙｓｏｓｏｍａｌＰｒｏ－Ｘａａｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、丝氨酸Ｄ－Ａｌａ－ＤＡｌａ羧肽酶（ＥＣ３．４．１６．４－ｓｅｒｉｎｅ－ｔｙｐｅＤ－Ａｌａ－ＤＡｌａｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、羧肽酶Ｃ（ＥＣ３．４．１６．５－ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＣ）、羧肽酶Ｄ（ＥＣ３．４．１６．６－ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＤ）。其中，羧肽酶Ｃ因可水解所有具有羧基末端的氨基酸（羟脯氨酸除外），已成为蛋白质多肽链Ｃ末端分析中常用工具酶；此外羧肽酶Ｃ还可通过转肽反应将其它氨基酸衍生物或亲核物质以取代肽链末端的氨基酸残基从而形成新肽。在所有丝氨酸羧肽酶的活性位点中，含有１个由Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ按独特顺序构成的具有催化功能的结构单元，其中Ｓｅｒ是亲核位点、Ａｓｐ是亲电子体、Ｈｉｓ是基底。这一结构单元可被异氟磷（ＤＦＰ）、甲苯磺酰丙氨酸和酮苯丙氨酸抑制［１０］。此外，丝氨酸羧肽酶活性被Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｈｇ２＋等金属离子抑制，Ｍｇ２＋则促进羧肽酶活性［１１］。１．２金属羧肽酶金属羧肽酶是一类存在于细胞外，帮助蛋白质消化，在中性或弱碱性条件下具有极大活性的羧肽酶，包括：羧肽酶Ａ、Ｂ、赖氨酸羧肽酶、甘氨酸羧肽酶和谷氨酸羧肽酶等。其中，羧肽酶Ａ能释放Ｃ末端氨基酸（除脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸和赖氨酸），对具有芳香族侧链和大脂肪侧链的羧基端氨基酸具有很强水解能力。相比较而言，羧肽酶Ａ释放非极性氨基酸、组氨酸、苏氨酸、高丝氨酸等的速度比较快，但对天冬氨酸、丝氨酸、蛋氨酸以及赖氨酸等的释放速度则比较缓慢，但随着ｐＨ值的增加，对天冬氨酸、丝氨酸和蛋氨酸的作用速度也不断加快。羧肽酶Ａ的催化需要锌离子参与，它是第一个被发现的金属酶和锌酶，正是因为如此，羧肽酶Ａ是动力学、结构和光谱方法等方面研究最为清楚的水解酶，为其他锌酶的研究奠定了坚实的基础。羧肽酶Ｂ仅水解以碱性氨基酸（如精氨酸和赖氨酸）为Ｃ末端残基的肽键，大部分特性与羧肽酶Ａ很相似，唯一不同点在于羧肽酶Ｂ对Ｃ－末端是精氨酸和赖氨酸残基的肽键具有很高的水解活性，有时也能切断其它疏水性氨基酸残基。PH8时羧肽酶Ｂ活性达到最大值，偏酸性和偏碱性的条件都会降低酶活，当ｐＨ≥１２时，活性则完全丧失。赖氨酸羧肽酶能降解蛋白末端的基本氨基酸，因对赖氨酸具有很强的活性而被命名为赖氨酸羧肽酶，通常用于调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究。甘氨酸羧肽酶又名羧肽酶Ｓ，能降解倒数第二个为甘氨酸的肽，如Ｚ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ。羧肽酶Ｅ、羧肽酶Ｍ、羧肽酶Ｕ和羧肽酶Ｂ类似，主要降Ｃ－末端为精氨酸和赖氨酸的肽。谷氨酸羧肽酶又名羧肽酶Ｇ，能作用于含Ｎ－酰化底物的Ｃ－末端，释放谷氨酸，用于甲氨蝶呤的解毒及抗体导向酶－前药疗法。Ｃｄ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋都能不同程度地提高金属羧肽酶的活性，但Ｃｕ２＋、Ｈｇ２＋、ＥＤＴＡ、３－Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ、土豆羧肽酶抑制剂等则抑制金属羧肽酶活性。１．３半胱氨酸羧肽酶半胱氨酸羧肽酶又称组织蛋白酶Ｘ、组织蛋白酶Ｚ、酸性羧肽酶，是一类由Ｃｙｓ８４、Ｈｉｓ２３３和Ａｓｎ２５４组成活性中心，催化功能结构域中包含半胱氨酸（Ｃｙｓ）的羧肽酶。存在于牛）、鲤鱼（Ｃｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏ）、人（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）、小家鼠（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）、褐牙鲆（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓｏｌｉｖａｃｅｕｓ）等动物的消化道、脑、眼、心脏、肝等组织的细胞液中［１６］，对Ｃ－末端氨基酸具有广谱活性，但对Ｃ－末端Ｐｒｏ无活性作用，内切酶活性很弱［１７］。二、羧肽酶的来源及其分布根据来源分类，羧肽酶可分为动物羧肽酶、植物羧肽酶和微生物羧肽酶。在哺乳动物的不同组织中含有一系列的金属羧肽酶，以执行相应的生理功能。如胰腺羧肽酶Ａ和Ｂ主要帮助消化食物、羧肽酶Ｅ选择性地加工生物活性肽、羧肽酶Ｍ选择性地参与肽类激素的加工、羧肽酶Ｄ（高尔基体中）和羧肽酶Ｎ（血浆中）参与肽和蛋白质的加工。对动物源羧肽酶的研究，主要集中于人、猪、牛、小家鼠等。其中对人源羧肽酶的研究是为了解析羧肽酶在人体内的作用机制，以进行疾病的诊断、治疗；而对小家鼠羧肽酶的研究则是作为研究模型，以解析人源羧肽酶生理机制。动物源羧肽酶的另一主要研究领域是应用于胰岛素、多肽的工业化生产中。目前，已从大麦、小麦、拟南芥、水稻，番茄、绿豆等多种植物中分离到丝氨酸羧肽酶（ＳＣＰ）及丝氨酸羧肽酶类蛋白（ＳＣＰＬ）的基因和蛋白，除参与催化蛋白水解反应、植物损伤应答反应外，还在油菜素内酯、芥子酰基苹果酸等化合物的合成中发挥积极的作用。微生物羧肽酶包括微生物自身生产的羧肽酶及以微生物为宿主过量表达的羧肽酶。已有研究表明，酵母、假单胞杆菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、曲霉等是微生物羧肽酶的主要来源，所生产的羧肽酶主要是丝氨酸羧肽酶，具有广泛的底物特异性。源于酵母细胞的羧肽酶Ｙ是使用范围最为广泛的羧肽酶，用于将猪胰岛素Ｂ链末端的丙氨酞胺残基以苏氨酸残基取代，以半合成人胰岛素（通过羧肽酶的转肽作用）、蛋白序列的测定等；而源于假单胞杆菌的羧肽酶Ｇ可用于甲氨蝶呤解毒、ＡＤＥＰＴ。此外，研究发现存在于米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉等真核微生物液泡中的羧肽酶，可用于多肽脱苦、生物活性多肽的延长或特异性修饰等。三、羧肽酶的基因表达策略目前，商业应用的羧肽酶主要来源于猪胰腺，价格比较昂贵，且存在一定浓度的蛋白酶。因此，研究人员将关注点转移到利用基因工程策略或方法在微生物宿主中异源表达和生产羧肽酶，展现了良好的应用前景。采用基因工程策略过量表达动物源羧肽酶主要用于进行基因测序、机理研究。测序结果（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ４７７３２．１）表明，ＣＰＡ含４１９个氨基酸，１－１６位为信号肽，１７－１１０位为前肽，１１１－４１９位为成熟肽，Ｚｎ２＋结合位点为第１１４、１１７、２４８位，其催化位点及抑制剂结合位点均已测出。ＣＰＡ为单一的多肽链，在体内首先合成出来的是无活性的羧肽酶Ａ（ｐｒｏｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＡ），以亚基双聚体或三聚体形式存在。经分辨率为０．２ｎｍ的Ｘ射线结构测定，羧肽酶分子呈椭圆球形，大小为５．０ｎｍ×４．２ｎｍ×３．８ｎｍ。羧肽酶Ｈ又称羧肽酶Ｅ是由４７６个氨基酸组成，前２５个氨基酸为信号肽（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１８６４．１），向斌等人已构建人羧基肽酶Ｈ（ＣＰＨ）的原核表达系统，获得其重组蛋白，并初步应用于人ＣＰＨ自身抗体（ＣＰＨ－Ａｂ）的检测［２１］。人肥大细胞羧肽酶基因（ＮＰ＿００１８６１．２）编码４１７个氨基酸，与胰腺来源的羧肽酶同源性仅为３６．２４％。大鼠羧肽酶Ｂ基因（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ４０８７２．１）序列大小为１２４５ｂｐ，编码４１５个氨基酸，与人羧肽酶Ｂ（ＮＭ＿００１８７１．２）氨基酸序列的同源性为７５．７８％。尽管已有多种植物源羧肽酶基因被测序，如拟南芥（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＥＤ９３１０４．１）、豌豆（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ９２２１６．１）、莱茵衣藻（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＤＰ０７５６７．１）等。然而，将植物源羧肽酶基因进行克隆表达并进行深入研究的案例很少。大量微生物源的羧肽酶基因已被测序，Ｙｏｓｈｉｄａ等成功克隆并测定了编码串珠镰孢菌羧肽酶基因的全长ｃＤＮＡ长标蛋白氨基端融合了ＦＬＡＧ－ｔａｇ（６肽）标签，易于表达产物的检测。四、展望综上，目前在羧肽酶的应用、性质、来源分布、克隆表达等方面开展了大量的研究工作，然而，羧肽酶的研究还需要在以下方面开展工作：（１）获得大量的羧肽酶：由于从动物组织中提取的羧肽酶价格昂贵，如何通过借助基因重组技术和生化工程的高密度发酵技术，获得专一、纯度高的羧肽酶，对于拓展其应用领域，具有重要的现实意义；（２）解析羧肽酶的生理作用：目前羧肽酶的应用范围主要集中在医药和食品加工中，由于酿酒酵母与人具有较高的同源性，如能以酿酒酵母为研究模型，解析羧肽酶在人体内生理作用，及如何影响疾病的发生发展过程，以对疾病进行预防和治疗；（３）优良性能的定向改造，拓展应用领域：从羧肽酶的基因序列入手，在阐释分子结构与功能之间的关系的基础上，借助蛋白质工程的方法和策略，增强羧肽酶的底物适应性、催化效率、提高酸碱耐受性以及拓宽最适作用温度范围等工业应用特性，以拓展应用领域。六、参考文献1、冯英，刘庆坡，贾佳等．拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白家族的基因组学分析［Ｊ］．遗传学报，２００５，３２（８）：2、付静，杨媚，李理，等．雅致放射毛霉３．２７７８羧肽酶性质及其活性中心结构的研究［Ｊ］．中国酿造，２０１０，２１６］3、许大洲，王树英，金坚，等．在大肠杆菌中融合表达重组羧肽酶抑制剂［Ｊ］．食品与生物技术学报，２００６，２５（６）：１１９－