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1日本锦鲤感染嗜水气单胞菌引起的相关病毒血症的组织病理学观察摘要：嗜水气单胞菌感染引发相关ANA-AKI-BYO病毒血症是目前在日本锦鲤有高度传染性的一种疾病。当前的研究，是为了确定电晕状病毒和A之间的相互关系。我们通过患病鲤鱼与正常鲤鱼之间的自然同居进行细菌的人为传染实验发现正常鲤鱼皮肤已被轻微受损。实验成功表现出电晕状病毒病毒血症和A的联合作用。在嗜水气单胞菌的感染中。患病的鲤鱼表现出规模囊性水肿，腹水及眼球突出，皮肤形成溃疡等症状。另外还有由于电晕状病毒和A引起感染的病理变化。发生嗜水气单胞菌感染后，全身水肿的皮肤表现出表皮分离，扩大规模液囊，以及真皮水肿并伴有出血和坏死。底层横纹肌水肿且肌肉纤维发生明显萎缩。肝细胞发生萎缩或肿胀呈颗粒状。肾小管细胞呈空泡变性，混浊肿胀，坏死和损伤。在脾和造血组织的巨噬细胞以及肝细胞中发生铁血黄素沉积。因为细菌细胞不直接侵入这些受影响的组织，所以这些变化可能受细菌毒素诱导。关键词：病毒血症科罗纳类病毒嗜水气单胞菌鲤鱼皮肤溃疡全身水肿肾病2简介据最近报道，一种新的病毒病，viremia-associatedANA-AKI-BYO，，在日本锦鲤中普遍流行（宫崎等，2000）。我们确定首次患电晕状病毒（CLV）血症的患病鲤鱼是受到水传播的二次细菌入侵，导致皮肤溃疡的形成。且CLV对鲤鱼本身是致死的。1999年，通过长期观察发现患病鲤鱼出现规模囊水肿，眼球突出，腹水以及皮肤溃疡等症状。另外可以从病变真皮和内脏器官分离的CLV，从水肿鳞片囊，溃疡性病变和腹水中分离嗜水气单胞菌。病毒血症CLV与嗜水气单胞菌联合感染并不令人意外，因为它之前已被大众所知。虽然病毒和细菌，以及其病理特征之间的相互关系尚未完全确定，但众所周知，患病鲤鱼患有“鲤春病毒血症”（Rhab-dovirus鲤鱼感染，Fijan等1971）常常是因为感染嗜水气单胞菌。而复感染被称为“传染性水肿'（Fijan1972）。在本研究中，这种复杂的疾病被发现在饲养有高度传染性鲤鱼群的池塘中。因此，我们进行感染实验以确定病毒和细菌是如何被同居的自然患病鲤鱼传染给皮肤已经轻微受损的健康鲤鱼。结果发现，合并感染成功实现。并通过电子显微镜检查病鱼组织，观察其复杂的病理特征来确定疾病与CLV和嗜水气单胞菌之间的相互关系。材料与方法患病的鲤鱼和鲫鱼的健康：患病鲤鱼（3岁龄，200〜300克），；来至于饲养在1999年6月和七月之间的寒春的鱼群中，通常表现为水肿但不发生皮肤溃烂。在六月收集五条病鱼进行组织病理学检查和病毒和细菌分离。七月，从同一组的鱼中再次收集16条病鱼作为供体进行感染实验。为实验从池塘中挑选未感染“viremia-associatedana-aki-byo”病毒的健康鲤鱼（2至4岁龄）。这些鱼立即以50ppm的福尔马林溶液浸泡24小时以除去皮肤和鳃上的寄生物。3感染实验：每两只皮肤溃疡且自然患病的鲤鱼被安置在6个养鱼池（30L20℃）中通气，，而剩下的病鱼被放养在水箱中（300L20℃）。在实验期间，当病鱼在养鱼池中死亡，需要从另备份组中选取另一条病鱼替换。同居前，去除掉几个身体受到轻度损伤的健康鲤鱼（2年生，40至70g）。在每一个养鱼池中，3或四只健康鱼与两条病鱼进行共同饲养。当实验鱼变得奄奄一息，立即清除它们，并更换新的实验鱼。这个实验中，在30天20°C环境下，.共有30条实验鱼经历了同居实验。作为对照，6例健康鱼（2岁，50克）的皮肤已经损伤，以同样的方式作为实验鱼的健康鲤鱼（3岁，类似于自然病鱼的大小）也出现相同症状。病毒和细菌的分离：根据宫崎等人的说法，CLV病毒是从天然病鱼和实验病鱼中分离出来的（2000）。从溃疡性病变皮肤，水肿鳞片囊，腹水和肾中分离的细菌，在心脏浸液琼脂平皿上20℃下进行3天培养。对于大多数从水肿鳞片囊，腹水和肾脏的样品，采用API20测试生长在琼脂平板上单一类型的细菌是否是嗜水气单胞菌。这种细菌表现出对绵羊血琼脂平板上溶血活性。这显示出突出的均裂一些菌落选择人工感染。人工感染嗜水气单胞菌：CLV的致病性在我们以前的研究（宫崎等，2000）有所描述。我们对分离的嗜水气单的致病性进行了检测。生物体在20℃下培养在心脏浸液肉汤（HI肉汤）48小时。离心培养物以3000×g的速度离心15分钟，使细胞悬浮在盐水上。向10条鲤鱼进行皮下注射菌悬液（0.5毫升），剂量为7.8×104.0CFUml-1。为对照，将5条鲤鱼注射相同量的无菌盐水。如后面所指出的，在HI肉汤培养所述细菌并不致病。我们试图在Luria-BERTANI肉汤（LB肉汤用于培养大肠杆菌;细菌蛋白胨10克，酵母提取物5g，氯化钠5克，水1000ml）中培养细菌，其中补充有从健康鲤鱼（4年生2公斤）中提取的5％鲤鱼血清。因为嗜水气单胞菌经常被发现在患病金鱼鲫鱼（Kubota等.1981），鲫鱼内（Miyazaki&Kaige，1986年）和日本鳗鲡鳗鲡（Egusa1978,Miyazaki1980,Kubota等.1981），以及健康鱼4（Sorimachi&Egusa1971,Aoki1974,1975,Kanai等.1977)的消化肠道中，所以选择使用LB培养基。因此，在该方面，嗜水气单胞菌类似于大肠杆菌。此外，嗜水气单胞菌出现在患病鲤鱼的鳞片囊和腹水中。因此，我们选用LB培养基为基础液，用鲤鱼血清补充它。细菌在20℃下可以良好生长在该培养基中48小时。再次制备细菌悬浮液，5条鲤鱼注入2.6×105.0CFU毫升-1或1ml的剂量于皮肤下，在6条鲤鱼腹部空腔内注射同样剂量0.5ml5.2×105.0CFU毫升-1的菌悬液。建立两个对照组，每一个类型的注射，5鱼注射等量的无菌生理盐水并在20°C下的养鱼池中.喂养观察了30天，然后取样进行组织病理学检查。没有注射的鱼观测其死亡期。病理组织学和电子显微镜检查：用1.5％氨基甲酸乙酯溶液进行麻醉，对外部采样后再进行内部解剖和观察。用于组织学观察的病变真皮和内脏器官的组织固定在10％磷酸盐缓冲的福尔马林溶液中。根据标准技术制备苏木精-伊红（H＆E），阿赞，吉姆萨（对于细菌），柏林蓝（对于含铁血黄素）和高碘酸希夫（PAS）用于固定组织的生化反应。根据电子显微镜（EM）标准技术将剩余的病变真皮，心脏，脾和肾的组织用70％的Karnovsky和1％OSO4的溶液处理并固定。结论病鱼的自然爆发自然患病鲤鱼出现松果样外观（规模囊性水肿）肿胀并伴随着皮内出血及毛细血管扩张，眼球突出和腹部腹水膨胀另外还形成了皮肤溃疡（图1A）。皮肤溃疡发生后的10到14天，病鱼逐渐发展上述水肿变化且活着。腹腔内包含有清晰血性腹水。肝，脾，肾和鳃表色苍白。在一些鱼中，肠和脾出血，横纹肌有明显水肿，并含有浑浊或发白肌纤维。在所有的病鱼中，可以从规模囊水肿和腹水和A.中分离出嗜水气单胞菌进行纯培养。从病变的溃疡皮肤中将嗜水气单胞菌与其他细菌进行分离。我们可以成功的从溃疡性皮肤，脾，肾和心脏中分离出宫崎等人（2000）所说的能导致相同的细胞病变效应的那种病毒。5图.1.鲤鱼（A）自然患病鲤鱼吻部，和鳃盖尾鳍显示溃疡性病变，且有规模囊水肿，内皮出血，腹水及眼球突出。（B）患病实验用鲤鱼与同居自然病鱼：这种鱼表现在对一个受伤的部位的身体发生皮肤溃疡伴且随着出血和水肿规模囊。6溃疡性病变损失的组织病理学症状大多与“viremia-associatedANA-AKI-BYO'相同（Miyazaki等人，2000）。然而，在一些区域显示水肿规模囊和皮内出血，且水肿规模囊不断扩大，表皮脱落，真皮疏松结缔中组织规模囊周围，出血，坏死纤维细胞，裂解红细胞和扩张毛细血管上层有纤维蛋白的沉积。底层真皮致密结缔组织也出现水肿。皮下脂肪组织有明显的出血和炎性细胞的浸润。横向肌肉有明显的水肿和出血，肌肉纤维是广泛萎缩且变得破碎（图2A）。虽然细菌是从水肿规模型囊分离的，但是姬姆萨染色结果显示，细菌细胞在这些病变没有显著倍增。在电镜观察下，皮肤损伤处中毛细血管内皮细胞（图2B）和纤维细胞（图2D）中显示的许多CLV颗粒伴随着形成电子致密夹杂物，但在细胞质中没有狭窄管状结构。此外，许多坏死毛细血中的血管内皮细胞呈现细胞核退化，线粒体退化现象，基底膜很多小块状物质且边界不清。因此，毛细管被部分损坏，并允许红细胞从毛细血管（图2C）泄漏。受毛细血管影响的周边胶原纤维发生水肿分离并呈边界不清带型。底层的横向肌肉包含许多肌纤维呈现出碎片化的肌原纤维，线粒体退化和内质网扩大。在心脏的心室和心房，心脏肌纤维含有支离破碎的肌原纤维发生空泡变性，或包含凝结肌原纤维存在萎缩心肌的内层。在心肌的外层，出血有时发生在受损的肌肉纤维（图3A）。红细胞的小血块形成在管腔心内膜上。在一些鱼中，管腔包含了很多来源于红细胞裂解的细胞核。心外膜表现出血和周围扩张血管炎性细胞渗透。然而，没有证据表明，在坏死性病变心脏内有任何增殖活跃的细菌细胞。电子显微镜下的心肌纤维，通常受影响的纤维具有零散肌原纤维束，许多线粒体退化，而且几乎没有糖原颗粒（图3B）。这一批肌纤维均显着零散和紊乱，或者是裂解伴有肿胀带状。退化线粒体显示2种不同类型损坏的：要么扩大要么凝固。扩大线粒体通常显示为圆形，嵴损坏且无规则。在凝结的线粒体中，嵴大部分消失了，取而代之用非晶体物质。二价阳离子的许多基质的电子致密颗粒会沉积在这些损伤的线粒体。空泡肌纤维具有很多空的空间，在肌浆中有扩展流畅的内质网（SER）和小数目CLV颗粒，而萎缩的肌肉纤维的肌浆中的CLV粒子通常很难观察到.7图.2.鲤鱼在自然爆发。（A-D）水肿病变皮肤。（A）皮肤水肿病变。表皮被分离。底层真皮疏松结缔组织是高度水肿，并伴随着轻微的出血。出血性皮损好发于皮下的脂肪组织和肌肉外侧。H＆E。比例尺=200微米。（B）真皮毛细血管的内皮细胞的电子显微镜照片，出现许多电晕状病毒（CLV）颗粒（箭头）并伴随着电子致密物质的生成的夹杂结晶。基底膜难以界定。=1微米。（C）真皮毛细血管的电子显微照片展现具有坏死内皮细胞和未清除的基底膜。毛细血管（箭头）被部分损坏，并允许红细胞漏出。比例尺=2.5微米。（D）一种皮肤纤维细胞的电子显微照片。许多CLV颗粒（箭头）和电子致密材料出现在细胞质中。比例尺=2μm的。B：基底膜;C：胶原纤维;D：真皮致密结缔组织;E：红细胞;G：粒细胞;H：出血;I：含结晶夹杂电子致密材料;L：真皮疏松结缔组织;M：横向肌肉8在肝脏中，肝细胞萎缩或肿胀且呈粒状外形（图3C）。有少数肝细胞呈现含铁血黄素沉积颗粒和含铁血黄素巨噬细胞的血窦。该含铁血黄素颗粒柏林蓝染色后为深蓝色。在电子显微镜观察下的混浊肿胀肝细胞，其扩大核边际显示有染色质沉积，嵴破坏的线粒体明显扩大，支离破碎，粗面内质网增大（RER），没有糖原颗粒，且电子透亮细胞质中无CLV颗粒（图3D）。一些膨胀RER包含电子致密物质。萎缩肝细胞具有少量凝结的线粒体，许多零散的RER，含铁血黄素的夹杂物具有高电子密度的细颗粒和无糖原颗粒。脾中许多坏死细胞在浆和护套组织发生纤维蛋白沉积。脾中大多数巨噬细胞显示有许多有吞噬作用的红细胞和含铁血黄素沉积或蜡样色素（图4A）。电子显微镜下的脾脏，可见护套组织中的网状细胞在包含了众多的含铁血黄素电子致密细颗粒。（图4B）。网状细胞的护套组织和血窦坏死并显示许多CLV颗粒，在电子透亮的细胞质中有许多狭窄管状，含有结晶夹杂电子致密物质，和胀扩大的内质网（图4C）。肾脏显示出肾小管上皮细胞混浊肿胀，空泡变性并伴随有核变性，管状破坏随后坏死（图4D）。有时，这些受影响肾小管细胞，像正常肾小管上皮细胞一样，含有含铁血黄素颗粒。肾小球包含的坏死细胞有时会被部分摧毁。这些坏死性病变并没有表现出任何细菌入侵的证据。在电子显微镜下，空泡肾小管细胞显示出有巨大的空余空间，变圆，线粒体发生退化，电子透亮细胞质发生网状扩大（图5A）。凝固性坏死的肾小管细胞表现出浓缩线粒体中的嵴消失。在整个细胞（图5B）中沉积许多为二价阳离子的基层电子致密颗粒。此外，坏死的肾小管上皮细胞有明显破裂的