翻译环糊精与酶的活性位点之间的底物桥接所触发的一种独特的抑制模式

环糊精与酶的活性位点之间的底物桥接所触发的一种独特的抑制模式摘要：背景：甲硫氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素（MetAMC）作为甲硫氨酸氨基肽酶（MetAP）的催化反应的酶作用物，并通常用于筛选化合物以确定潜在的抗生素剂。为了筛选酶的抑制剂，我们观察到用于的溶解疏水性抑制剂——2—羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)，抑制了酶的催化活性，这种抑制不完全是由于HP-β-CD的底物吸收作用。方法：通过进行稳态动力学，配体-受体结合，X射线晶体学和分子模拟研究方法，对HP-β-CD对MetAP的介质抑制机理进行探讨。结果：β环糊精酶作用物（β-CD-MetAMC）复合物的X射线晶体学数据表明虽然酶作用物的7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）部分是在环糊精（CD）腔内，但是蛋氨酸部分向外突出。HP-β-CD-MetAMC抑制MetAP的稳态动力学数据符合一个模型机制，该模型机制的底物在HP-β-CD和酶的活性位点口袋之间桥接，形成HP-β-CD-MetAMC-MetAP具有催化性质的无活性三元复合物。分子模型表明HP-β-CD结合MetAMC底物的易断裂键无法到达酶的催化中心的附近，并且因此底物无法裂解。结论：本文中所呈现的数据表明，这种酶和HP-β-CD的空腔之间的底物桥接是通过其表面的相互作用实现，并且所生成的复合物抑制了酶的活性。一般意义：由于蛋白质与HP-β-CD通过隔离底物的隐性相互作用，在生理条件下必须谨慎使用HP-β-CD对药物的传送。关键词：底物桥接环糊精甲硫氨酸氨基肽酶抑制环糊精–酶作用物复合物分子模型文中缩写：MetAP，甲硫氨酸氨基肽酶;MetAMC，甲硫氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素;HP-β-CD，2-羟丙基β环糊精7-amino-4-methylcoumarinAMC7-氨基-4-甲基香豆素β-CD-MetAMCβ环糊精酶作用物1.简介治疗性控制的需求不断增加，促使识别特定的新型酶目标，以及抑制或调节酶活性的新方法。在过去十年中，甲硫氨酸氨肽酶（MetAPs）已经被认为用于设计抗癌，抗菌和抗肥胖剂的潜在可能物质。甲硫氨酸氨基肽酶是细胞内翻译的过程中除去甲硫氨酸氨基末端而形成的多肽。在约80％的蛋白质中，必须从新合成的多肽中除去普遍存在的带有氨基末端的甲硫氨酸，以便为在生理条件下进行适当的处理，并且不这样做会导致产生非功能性的或不稳定的蛋白质。突变研究表明，产生MetAP的基因对于细菌生存和真核生物的细胞增殖是必不可少的。在各种报告中，MetAPs的抑制剂已被认为是潜在的抗癌，抗疟，抗菌和抗肥胖的药物。与存在于真核生物的酶（类型I和II）不同，细菌包含一个独特类型的酶（I型），便有了找出细菌的MetAP的选择性酶抑制剂作为理想抗生素剂的可能性。在筛选小分子化合物之时，我们确定了几个结合亲和力达到纳摩尔范围的大肠杆菌METAP的强效抑制剂。然而，由于存在一些溶解性差的化合物，我们无法在体内条件下评估这些抑制剂的功效。为了提高这类抑制剂的溶解度，我们考虑使用环糊精高分子载体。为了实现该实验，我们研究了环糊精在体外对酶催化反应的作用。环糊精是环状单元，由6，7或8个葡萄糖单元组成，分别称为α，β和γ环糊精，形成外部具有亲水性表面和亲脂性核心的环状分子。他们形成分子量范围大的化合物的包合物，其种类取决于相互作用的客体部分，并且其解离常数范围超过几个数量级。由于其含有非极性腔以及毒性低的特性，环糊精除了在化妆品和药品行业作为新的研究工具之外，还广泛应用作食品中的络合增溶剂。我们知道环糊精可以在生理条件下提高细胞的渗透性（除了溶解度和稳定性）来提高药物的生物利用度。不同的环糊精中，2-羟丙基β环糊精（本文称为的HP-β-CD）已被发现是最有效的药物载体，它已被成功地使用在难溶性药物的制剂。尝试使用HP-β-CD溶解和稳定一些MetAP抑制剂之时，我们发现上述的大分子载体大大损害了酶的催化活性。这个最初设想是仅由于在HP-β-CD的空腔内的酶的底物（MetAMC）的吸收作用，将消耗可利用水的酶作用物形式，导致酶的抑制作用。当这种简单模型已经与其他酶系统建立联系时，我们发现HP-β-CD使MetAP发生抑制作用主要是由于HP-β-CD-MetAMC-MetAP复合物的形成，并且该复合物是通过HP-β-CD和酶的活性位点之间的酶底物的桥接而生成。正如结果部分将要详述的，酶作用物的AMC的部分仍限于环糊精的空腔之中，而甲硫氨酸部分在酶的活性位点内相互作用。因为这种组合物质是失活的复合物，所以其整体的酶催化效率受损。以上结论所基于的实验数据将在下面章节讨论。2材料和方法2.1材料2-羟丙基-β-环糊精和β-环糊精购自Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，密苏里州）。甲硫氨酰7-氨基-4-甲基香豆素（MetAMC）从恩佐生命科学国际有限公司LifeSciencesInternationalInc(（普利茅斯会议，PA）购买。所有其他试剂均为分析纯。2.2蛋氨酸氨基肽酶（MetAP）的作用表达及净化大肠杆菌的MetAP的重组形式（EcMetAP）的作用表达和纯化正如先前所述。MetAP的纯度由SDS-PAGE验证，并且其蛋白质浓度由Bradford方法测定。酶贮存于-70℃，含30％甘油中的存储缓冲液中（25毫摩尔每升缓冲液，pH值7.5，100毫摩尔每升NaCl）。2.3酶的活性（1μM=1μmol/L微摩尔每升）测定MetAP的催化活性是于室温下使用MetAMC作为荧光底物，并放于96孔板中测定，所用仪器为GeminiEM酶标仪（MolecularDevices公司，桑尼维尔，加州）。在一个典型的测定系统中，0.75微摩尔每升的MetAP加到测定缓冲液（25微摩尔每升羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），pH值7.5，100毫摩尔每升氯化钠，10微摩尔每升氯化钴），并且通过加入MetAMC的而启动该测定。在光波460nm（λex=360nm）处监测该反应进程。反应轨迹所指代的线性区域的斜率可以作为酶的催化反应初始速率的大小。斜率可换算成单位时间生成的产物浓度，而反应曲线的斜率可由在与酶测法相同的条件下使用7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）（0.01-1毫摩尔每升）的标准曲线下获得的荧光量来测定。2.4荧光分光光度的研究（QuantaMasterTM专业荧光稳态测量系统)MetAMC结合到HP-β-CD的光谱采集和荧光光谱滴定研究是在荧光稳态测量系统（光子技术国际，伯明翰，新泽西州）上进行。在上述测定缓冲液中，HP-β-CD滴定到10微摩尔每升MetAMC中，其荧光发射光谱则使用一个氙灯光源（λex=315纳米，λem=360-540纳米）测量。可使用一个320nm的长通滤波器和取5个光谱的平均值来提高信噪比。在波长465nm处的荧光强度的变化是HP-β-CD浓度的函数，正如Wangetal等人用Origin7.0软件所描述的二次函数的完整解决方案一样来进行数据分析的来得到荧光强度变化。2.5MetAP的动力学研究在不同的底物浓度（10-800微摩尔每升MetAMC）测定MetAP的催化活性（如上所述）。从最初的反应速度得到的MetAP催化反应的Km和kcat参数可作为底物浓度的度量，并且其数据由Dynafit3软件（BioKin有限公司，水城，MA）进行分析。对于酶的抑制性研究而言，测定酶的活性须在不同浓度的底物（10-800微摩尔每升）以及HP-β-CD（0-12毫摩尔每升）的环境下进行。对于不同类型的抑制模式，Dynafit软件分析了稳态动力学数据。最佳抑制模式是由Akaike赤池重量确定的，而赤池重量是根据伯纳姆和安德森使用模式判别分析得出的。2.6β-CD-MetAMC络合物的结晶化和结构确定对于β-CD-MetAMC络合物的结晶化，先分别在水乙醇混合物中准备1毫摩尔β环糊精（β-CD）和1毫摩尔MetAMC。再将溶液缓慢地混合加热到60°C，保持2小时。其次该反应混合物慢慢冷却，使β-CD-MetAMC晶体形成。单晶x射线衍射数据收集在一个带有顶点的2CCD探测器的衍射仪(ⅠμS微焦的Cu辐射)中。解析其复合物的结构使用直接法和Apex2v2010.9-1软件包F2，之后使用SAINTv7.68A和多重扫描吸收校正。2.7分子模拟研究使用软件AUTODOCK维娜1.1.1对MetAMC到HP-β-CD和EcMetAP进行对接研究。物理数据库PDB（2GTX）的EcMetAP晶体结构可用作酶的模型。从β-CDMetAMC复合物晶体化而得的β-CD晶体结构可作为建立HP-β-CD结构的分子模型。使用AUTODOCK工具准备输入文件的对接。为了使HP-β-CD-MetAMC络合物与EcMetAP对接，网格盒（28×28×26）集中于酶的活性位点处，Vina的详细参数设定在50。在NAMD2.8软件全原子力场环境下进行分子动力学模拟实验，此实验为输入文件作准备。使用SWISS-PARAM生成HP-β-CD和MetAMC的拓扑结构和参数文件。在典型的设置中，分子置于在一个与期望复合物相近的构象中。蛋白质骨架受到限制，其分子溶解在水球体的填充胶囊中，水的生物化学与生物物理学特性为TIP3P水模型，100毫摩尔每升NaCl的浓度。模拟实验运行的实验条件为，温度300K（Langevin动力学），球面边界条件为150PS，1fs的步骤时间。非键之间的相互作用是截止在12Å，在10Å处使用开关函数，使用抖动算法来限制键长和键的水分子角度。RMSD分析证实了该系统的平衡性和采用NAMD计算稳定系统的化学键能量。3.结果3.1HP-β-CD对MetAP催化反应的效果在初步的处理过程中，我们注意到由于存在HP-β-CD，荧光底物（MetAMC）的MetAP催化裂解反应受到抑制。为了阐明的HP-β-CD介导抑制的分子基础，我们在400微摩尔每升MetAMC底物可作为增加HP-β-CD浓度的功能的前提下确定了MetAP催化反应的时间进程。图1示出由于MetAMC酶催化裂解甲硫氨酸和AMC，荧光强度（λex=360nm处，λem=460nm）作为时间的函数线性增加。由图的斜率得到酶催化的初始速率，而HP-β-CD浓度增加时初始速率下降。这样的期望符合文献先例，环糊精通过隔离它们的底物来抑制酶的催化活性，从而减少了溶液中游离基质的浓度。为了探究HP-β-CD抑制MetAP的原因是否完全是由于酶的底物的枯竭;我们着手确定MetAMC底物与HP-β-CD的结合亲和力，以及确定在相同的实验条件下MetAP催化反应的动力学参数。如下所示，这些参数使我们能够预测在多种实验条件下MetAP催化反应的速率（其实验基础是自由底物是酶催化过程中使用的唯一底物），并它们与实验中观察到的现象进行比较。让我们惊讶的是，无论在什么情况下预测的酶催化速率与实验观察到的速率都相符。如下所述，实验所观察到的数据和预测率之间的这种差距促使我们解开HP-β-CD对MetAP催化反应的介导抑制机制。3.2HP-β-CD-MetAMC络合物的结合亲和力已知由于改变其微环境，荧光客体分子的光谱特性会受到结合到HP-β-CD的空腔的影响。为了探究HP-β-CD对MetAMC的荧光光谱的影响，我们分别在没有和有20毫摩尔每升HP-β-CD的条件下进行实验，记录10微摩尔每升MetAMC（λex=315纳米）的荧光发射光谱（图2）。应当指出，虽然MetAMC的激发波长的最大值为350纳米，我们观察到，通过使用315纳米至320纳米激发波长的长通滤波器，在360-540纳米范围处的发射光谱的信噪比提高很大。图2的数据表明，在360纳米和460纳米波长下，HP-β-CD分别减小和增大MetAMC的荧光发射强度。利用荧光发射强度的变化作为MetAMC与HP-β-CD相互作用的信号，我们能够通过滴定固定浓度的MetAMC与逐级增加HP-β-CD的浓度来确定HP-β-CD-MetAMC络合物的结合亲和力。图2的插图显示MetAMC的荧光发射强度在460纳米（λex=315纳米）处时，HP-β-CD