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2015版耐胆盐革兰阴性菌及车间微生物知识介绍北京同仁堂股份南厂QC一.2015版耐胆盐革兰阴性菌变化1.耐胆盐革兰阴性菌简介2.大肠菌群简介3.大肠埃希菌简介4.指标的意义二.车间微生物污染的媒介1.空气；2.水；3.表面；4.人三.过程控制措施1.原料控制2.车间环境监控(1)空气；(2)水；(3)表面；(4)人3.取样4.培训一.2015版耐胆盐革兰阴性菌变化1.耐胆盐革兰阴性简介2.大肠菌群简介3.大肠埃希菌简介4.指标的意义1.耐胆盐革兰阴性菌简介2015版中国药典用耐胆盐革兰阴性菌检查法替代2010版大肠菌群检查法。耐胆盐革兰阴性菌检查法在检出率和准确率上均比大肠菌群检查法高，检测的菌种范围更广，实验结果易于判断。定义：耐胆盐革兰阴性菌指在胆汁酸中可以存活并繁殖的革兰阴性菌。包含分类及来源肠杆菌科：主要包含大肠菌群，来源于人畜粪便假单胞菌属：属于假单胞菌科，存在于土壤、水、空气中，人体皮肤、肠道和呼吸道均有存在气单胞菌属：属于弧菌科，自然界广泛存在，可从土壤及人类粪便中分离结构图耐胆盐革兰氏阴性菌（2015版方法）假单胞菌属肠杆菌科气单胞菌属沙门氏菌大肠菌群（2010版方法）志贺氏菌肠杆菌属埃希菌属枸橼酸菌属克雷伯菌属大肠埃希菌（大肠杆菌）2.大肠菌群简介大肠菌群是指在37℃生长时能发酵乳糖，24h内产酸产气的革兰阴性、氧化酶阴性、需氧或兼性厌氧的无芽孢杆菌，它不是分类学上的名称。大肠菌群包括埃希菌属（为主）肠杆菌属枸橼酸菌属克雷伯菌属这些属的细菌均来自于人和温血动物的肠道。大肠菌群中以埃希氏菌属为主，本群中典型大肠杆菌以外的菌属，除直接来自粪便外，也可能来自典型大肠杆菌排出体外7~30天后在环境中的变异。大肠菌群的灭菌大肠菌群对氯很敏感，在含有0.5～1ppm氯量的水中，很快死亡。大肠菌群等革兰氏阴性无芽孢杆菌对紫外线最敏感，用15瓦紫外线杀菌灯,距离50cm，照射1分钟，或距离10cm，照射6秒钟，几乎可全部杀死。大肠菌群在60℃，热死时间为5～30分钟，在70℃，热死时间为5分钟。3.大肠埃希菌简介大肠埃希菌，俗名大肠杆菌（革兰氏阴性短杆菌），周身鞭毛，能运动，无芽。是人和动物肠道中的正常栖居菌。大肠埃希菌的致病物质之一是血浆凝固酶。肠出血性大肠埃希菌O157:H7是导致1996年日本食物中毒暴发的罪魁祸首，它是出血性大肠埃希菌中的致病性血清型，主要侵犯小肠远端和结肠。大肠杆菌的代时大肠杆菌在不同温度下的代时：10度860min15度120min20度90min25度40min35度22min大肠杆菌的灭菌大肠杆菌生长温度范围7～49.5℃，最适生长温度37℃。致病性大肠杆菌在室温下能生存数周，在土壤和水中可达数月，O157大肠杆菌75℃时，1min即被杀死，但它耐低温。4.指标意义检出耐胆盐革兰阴性，表示样品受到污染。大肠菌群属于人或温血动物的粪便污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染，其他菌属则可能为粪便的陈旧污染。可以推测该药品中存在着肠道致病菌污染的可能性（如沙门氏菌、志贺氏菌等）。二.车间微生物污染的媒介1.空气2.水3.表面4.人二.车间微生物污染的媒介微生物特点：存在范围广生长速度快生存能力强洁净室内微生物在哪里空气水表面人员1.空气中的微生物在一般空气中，微生物达800~3500cfu/m3，空气并不是产生污染的介质，但它是污染的危险携带者。空气中的微生物多数附着在灰尘上，或以芽孢形式悬浮于空气中，1μm（微米）以下者处于悬浮状态，10μm以上者会逐渐沉下来而形成菌尘。充满微生物的尘埃和水滴就是通过空气作为侵袭我们产品的媒介而成为重要的污染源的。2.水中的微生物在严重污染的水中可达107cfu/ml（饮用水要求菌落总数≤100cfu/ml，大肠杆菌、大肠菌群不得检出）大肠杆菌经水塔或蓄水池储存后，短期内可大量繁殖繁殖在生产过程中，水是用量最大、应用最广泛的辅料之一。微生物在纯水中不能生长，但是水中总会有一定量的可溶性有机物和盐类被微生物利用作为他们的生长养料。3.表面的微生物空气中的湿度，使表面包裹上一层水膜，这层薄膜由于静电吸引而饱含尘埃微粒，表面因尘埃微粒和微生物由空气传播的回降而受到污染，一个表面看起来很干净，实际上已被千百万个微生物所污染，除非已经做了正确的消毒灭菌。4.人————洁净室中最大的微生物污染源人的头皮上有140万cfu/cm2，两手上约有4~40万，1g指甲污垢有38亿，1g粪便可达10~1000亿。人在代谢过程中会释放和分泌污染物。人体表面、衣服能沾染、携带污染物。人在洁净室内的各种动作也会产生微粒和微生物。人体内外微生物的分布1、皮肤：表皮葡萄球菌、白色葡萄球菌、八叠球菌属细菌、类白喉棒杆菌、金黄色葡萄球菌等2、口腔：唾液链球菌、溶血链球菌、乳酸杆菌、流感杆菌、类白喉棒杆菌等3、上呼吸道：包括喉、鼻道和鼻咽。甲型链球菌、奈氏球菌、肺炎球菌、流感杆菌、乙型链球菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌等。4、下呼吸道：包括气管、支气管和肺。健康人的下呼吸道是无菌的。5、胃肠道：大肠埃希氏菌、产气杆菌、变形杆菌、粪产碱杆菌、粪链球菌、梭杆菌属、螺旋体属、乳杆菌属、梭菌属、拟杆菌属中的一些种6、泌尿生殖道：常见的有嗜酸乳杆菌、类白喉棒杆菌、葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌国外实验资料，可以认为人员的发菌量有以下数据可供参考。①洁净室内当工作人员穿无菌服时，静止时的发菌量一般为10～300个／(min·人)，躯体一般活动时的发菌量为150～1000个／(min·人)，快步行走时的发菌量为900—2500个／(min·人)。②咳嗽一次的发菌量一般为70～700个／(min·人)，喷嚏一次的发菌量一般为4000～60000个／(min·人)。③穿平常衣服时发菌量为3300～62000个／(min·人)。④无口罩发菌量：有口罩发菌量为(1：7)～(1：14)。人体的发菌量三.过程控制措施1.原粉控制2.车间环境控制（1）空气（2）水（3）表面（4）人3.取样4.培训三.过程控制措施由于微生物检验的特殊性，属于概率检出，检验结果不复检，而丸剂剂型又没有最终灭菌，所以一定要加强生产过程的控制。1.原粉的控制丸剂作为原粉制剂，要注意前处理原料的净选。土壤中微生物复杂，动物药易滋生细菌，要严格按工艺净选处理。不要把微生物控制都寄托在照射灭菌上。因污染程度、物品摆放及时间的不同，辐照灭菌效果会有差异。2.车间环境监控车间监控要到位，注意最薄弱点的监控，尤其注意无摄像头的位置死角。对车间主要污染途径空气、水、表面、人进行重点关注。（1）空气的监控对空气采取过滤措施车间厂房的密闭性空气消毒（臭氧等）必须保持缓冲间门的关闭，不得同时开启。纯化水的制备、储存和分配应能防止微生物的滋生和污染。储罐和输送管道所用材料应无毒、耐腐蚀。管道的设计和安装应避免死角、盲管。储罐和管道要规定清洗、灭菌周期。纯化水清洗后的设备容器要最后进行消毒。（2）水的监控（3）表面的监控设备表面地面进入控制区的原、辅料，包材设备表面消毒剂浓度合适，针对特定范围内的细菌选择相应的消毒剂。消毒剂在三个月内轮换使用，以防细菌耐药。紫外灯消毒时记录使用时间，紫外灯的输出功率随使用时间增加而降低。超过平均寿命时，就达不到预期效果，必须更换。地面灰尘、微粒具有沉降和粘附的趋势，所以同一区域内，地面是微粒相对集中的地方，也是微生物相对较多的地方，墙壁也容易粘附灰尘。–不能用脚踏在垫板和料桶上。–不得跑跳、大声喧哗。–不靠在墙上或其他物体上。进入控制区的原、辅料，包材物料进入洁净区，用吸尘器或清洁抹布，将灰尘擦干净，脱去外包装。用紫外灭菌灯照射后，按物流走向经物流通道进入洁净区后，将物料存放在相应的位置。（4）人的监控更鞋、更衣、洗手、手消毒要严格履行规程；一更更鞋：脚底是最脏的部分。带发套：保证发套完整的包裹头发。换工作服：阻断外界沉降在外套上的灰尘。洗手：洗手一定要用洗手液和充足的流水。二更带口罩：洁净区内不能脱下口罩。穿洁净服：洁净区内不能解开连体服。手消毒：75%的酒精能杀灭99%的微生物。二次更鞋：洁净区工作鞋不能穿出二更的鞋箱外。发胶、香粉、耳环、戒指、项链、手链等不能带入洁净区；注意衣着、口罩、手套等是否到位；不携带个人物品进入生产区，不在生产区内吃东西；不能未更换工作服就进入生产区、洁净区；不能走物流通道；洁净区衣物与一般生产区衣物应分开分柜存放，不能交叉；避免不必要的走动和动作，不要频繁进出洁净室；离开工作场地必须脱掉工作服；要注意随手关门；在洁净室中，人的数量和活动应有特别严格的限制。当员工没有按照SOP进行工作时，车间的污染程度将增加。3.取样操作药品取样要严格按照GMP规范进行，确保样品的代表性。微生物污染有局部性的特点，对有疑问的药品应从最易发生问题点取样，可以适当加大取样面积及数量。这样可以更好地增加检出概率。4.人员培训药品GMP要求，进入洁净区的工作人员（包括维修、辅助人员）应定期进行卫生和微生物学基础知识、洁净作业等方面的培训及考核。要不断强化职工无菌意识，文明生产。生产区职工在生产时每个动作都要考虑是否有染菌的可能。谢谢