质粒DNA的分离纯化

质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。一、实验原理实验二质粒DNA的分离、纯化质粒DNA－煮沸法煮沸法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。质粒DNA－碱裂解法碱裂解法原理当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液菌种：E.coliMV1184（含pUC118）、E.coliK12（含pEGFP）设备：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，涡旋振荡器试剂：LB液体培养基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、RNA酶A、饱和酚:氯仿＝1:1二、材料、设备及试剂溶液Ⅰ：50mM葡萄糖；25mMTris·HCl（pH8.0）；10mMEDTA溶液Ⅱ：（新鲜配制）0.2NNaOH；1%SDS溶液Ⅲ：5MKAC10ml；冰醋酸11.5ml；水28.5ml1、取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于20μlTE缓冲液(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，储于-20℃冰箱中。三、操作步骤实验结果：获得质粒DNA（pUC118及pEGFP）四、注意事项——材料准备使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）四、注意事项——细胞裂解菌体量适当。培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断。复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染。G＋菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁。四、注意事项——核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法四、注意事项——核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解•TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase•pH值为8.0，可防止DNA发生酸解1.菌体老化2.碱裂解不充分3.菌体中无质粒4.溶液使用不当1.请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养2.可减少菌体用量或增加溶液的用量3.不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。4.溶液Ⅱ在温度较低时可能出现浑浊，置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液。五、质粒DNA提取常见问题问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？原因对策1.混有蛋白2.混有RNA3.混有基因组DNA1.不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质2.加入RNaseA室温放置一段时间3.加入溶液II和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。五、质粒DNA提取常见问题问题二：质粒纯度不高，如何解决？原因对策1.简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。2.染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？六、问题与讨论