质粒DNA的提取—碱变性提取法

山东大学生命科学学院08级生命基地2010年10月31日星期日[质粒DNA提取][碱变性提取法][栾一][山大南路27号]质粒DNA提取-碱变性提取法2/17质粒DNA的提取—碱变性提取法实验目的：1．掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。2．掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。仪器和材料；恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器；1.5ml离心管，50ml离心管；不同型号的的枪尖等。菌体：E.coliDH5α受菌体，具有AMPr标记的质粒PUC19。实验试剂：LB培养基，抗生素，溶液I，溶液II，溶液III，RNaseA母液，TE缓冲液，饱和酚等。试验原理：碱裂解法是较常用质粒的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。该方法操作简单，易于操作,一般实验室均可进行。十二烷基磺用于进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值质粒DNA提取-碱变性提取法3/17恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等.DNA粗提取所用的三种溶液：溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；溶液II，0.2MNaOH/1%SDS；溶液III，3M醋酸钾/2M醋酸；溶液I：任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果缺少溶液I，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。不过菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。质粒DNA提取-碱变性提取法4/17溶液II：是用新鲜的0.4N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提法。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4NNaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。溶液III：它加入后就会有大量的沉淀，大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。在1％的SDS溶液中慢慢加入5N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassiumdodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离质粒DNA提取-碱变性提取法5/17子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被SDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。那么2M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了SDS沉淀更充分一点。试验准备：1、溶液Ｉ:pH8.0GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/LTris－HCl）；2、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1％的SDS)，这个用的时候需现配。要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。3、溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60ml5mol/LKAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；质粒DNA提取-碱变性提取法6/174、异丙醇；采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1％左右，小分子所需PEG浓度高达20％。5、pH8.0TE缓冲液；10mmol/LTris－HCl，1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20ug/ml。实验步骤1、配制LB液体培养基，灭菌枪尖（1000ul/200ul/20ul）、2个50ml离心管，吸管，三角瓶等。2、把E.coliDH5α接种到含20mlLB和氨苄青霉素培养基中，在37摄氏度下，过夜培养。（注意无菌操作，防止杂菌干扰试验。）3、从摇床中取出过夜培养的细菌，轻轻混匀，取2-3ml菌液转接到含50ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃160r/min振荡培养过夜或至对数生长晚期。（经过一夜的培养，液体培养基底部浑浊，菌体大量沉淀。）4、先称量50ml灭菌离心管的质量m1，然后取一定量的菌体培养液于其中，7000rpm离心5min，弃上清液，收集菌体。5、沉淀中加5ml用冰预冷的溶液I，充分混合（需要剧烈振荡）。7000rpm离心5min，弃上清液，收集菌体。离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。称量其质量m2。（m2-m1是菌体湿重，干燥时使离心质粒DNA提取-碱变性提取法7/17管口向下，直到看不见液滴。加入离心管前，混匀菌体。加入溶液I时，一定要打散菌泥）。6、按湿菌体质量：溶液I质量=100mg：1ml的比例加入用冰预冷的溶液I，剧烈震荡，使菌体完全分开。冰浴5min。（打散菌体可用吹吸助溶，或漩涡振荡器。这一步主要是悬浮菌体）7、以二倍溶液I的体积量加入溶液II,慢慢颠倒，使之混匀（切勿剧烈震荡！），将离心管置于冰上5min,此时，溶液粘稠如蛋清。（滴加溶液II时，要逐滴加入，且要轻振溶液使之混匀，整体动作要快，因为强碱在溶液中停留时间不能过长，它也会破坏质粒DNA，如果操作慢时，可适当减少冰浴时间。G-细胞壁薄，所以强碱足以损坏细胞壁，不需要额外添加酶。加入溶液II，轻振后，溶液变得粘稠。）8、以1.5倍溶液I的体积加入冰浴后的溶液III，轻轻颠倒数次混匀，使之在粘稠的细菌裂解物中分布均匀，将离心管置于冰浴5min。（加入溶液III后，生成了大量的絮状沉淀，在冰上静置后，沉淀沉在溶液底部。溶液III中和强碱使质粒复性，不可剧烈震荡，可放冰上使它自己混匀。）9、以4℃，12000rpm离心15min，取上清液于另一新离心管中。（白色沉淀聚集在离心管一侧，上清液澄清。取离心管时，不改变其倾斜度，斜着插进枪尖，切勿触碰下部沉淀，吸取时，计算上清液体积。尽可能多的吸取上清液。）10、向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃下沉降30分钟。（加入上述溶液后，溶液变浑浊，不过浑浊程度明显小于加入溶液III。高浓度的盐有利于质粒的沉降。）质粒DNA提取-碱变性提取法8/1711、以12000rpm离心15min，小心倒去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使所有的液体流出。12、向DNA沉淀中加入70%冰乙醇5ml，以12000rpm离心5min，（离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。）去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上。（加入乙醇时，不打散沉淀洗涤盐分。枪尖深入离心管中，把液体打到沉淀的对面，然后转动离心管，使沉淀被液体覆盖。离心时，小心放置离心管位置，不改变质粒沉降位置，沉淀面朝外。粗提取的质粒呈浅黄色，随着水分的减少质粒变为无色。所以为了完全溶解质粒，在离心管上标记质粒所在位置是必要的。）13、将DNA沉淀溶于1mlTE缓冲液中，转移到一个Eppendorf管中，加入RNaseA（纯浓度50ug/ml），37℃保温1小时。（加入TE溶液溶解质粒时，可以用600ul溶解，400ul冲洗未完全转移的质粒。吹吸助溶时，用黄色枪尖吸取溶液，打在刚刚标记的质粒位置的上面，由于质粒本身黏着，容易产生气泡，枪尖溶液快打完时，不要把枪尖插入溶液中。加入酶后混匀溶液保温。）14、将上述的溶液平均分配到2个1.5ml的微量离心管中，每管0.5ml，分别加入与溶液等体积的饱和苯酚溶液，振荡混匀，以4℃，7000rpm,离心5min，取上层水相到一洁净的Eppendorf管中。（苯酚是经Tris饱和后的，显黄色。苯酚加入后，溶液分层，苯酚向下，下层呈浅黄色，上层溶液无色，在中间产生大量白色沉淀，此为变性后的蛋白质。通过两个离心管液体高度的比较，加入与原来溶液相同体积的苯酚。苯酚加入后，放平离心管，混合均匀。离心后，取离心管时不改变离心管的倾斜角度，用黄色枪尖吸取上层质粒DNA提取-碱变性提取法9/17清液。尽可能多的吸取上清液，但不要吸入蛋白质。）15、加入等体积的苯酚/氯仿溶液（1:1），振荡混匀，以4℃，7000rpm,离心5min，取上清液到一洁净的Eppendorf管中。（此时溶液中已看不到明显的白色沉淀，但相信仍有蛋白质的存在。）16、加入等体积的氯仿溶液，振荡混匀，以4℃，7000rpm,离心5min，取上清液到一洁净的Eppendorf管中。（苯酚是强的蛋白变性剂，但是苯酚留在质粒溶液中会影响DNA的酶切，它本身易被氧化，会损伤质粒。氯仿也是蛋白变性剂，但是比酚弱，且能溶解质粒中的脂类，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。）17、向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃下沉降30分钟。以12000rpm,离心15min，弃去上清液。（加入高盐和乙醇后，有少量的DNA生成，相对于粗的质粒，含量少了不少。）18、向DNA沉淀中加入70%冰乙醇200ul，以12000rpm离心5min，（离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。）去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥。（加入乙醇时，不打散沉淀洗涤盐分。枪尖深入离心管中，把液体