质粒DNA的提取与纯化

质粒DNA的提取与纯化实验目的：1掌握碱变性法提取质粒DNA的原理和各种试剂的作用及方法。2学习并掌握凝胶电泳法进行DNA的分离纯化的实验原理及方法。3学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。实验原理：简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶序列测定及分析。碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在PH高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA烦人氢键断裂双螺旋结构解开而变性，共价闭环状质粒DNA的大部分氢键断裂而变性，但两条互补链不完全分开。当用PH为4.6的KAc高盐溶液调节PH至中性时，变性的质粒DNA可发生复性恢复共价闭环的超螺旋结构而溶于溶液中，而染色体DNA不能复性，与不稳定大分子缠连在一起形成沉淀，通过离心与溶于溶液中的质粒DNA分离。溶于上清液中的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液使之凝聚成沉淀。由于RNA与DNA性质相似，乙醇沉淀DNA时也伴随着RNA的沉淀，可用RNA酶降解。质粒DNA溶液中的RNase以及一些可溶蛋白可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动速度可因电离子的大小，形态，电荷量的不同而有所差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因此可用凝胶电泳法分离，鉴定和纯化DNA片段。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭（EB）染色直接观察到，甚至含量少至20Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：（1）样品DNA分子的大小（2）缓冲液,（3）温度（4）DNA分子的构象：一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。（5）琼脂糖浓度：通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。（6）电泳所用电场：凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V／cm。实验准备实验仪器与材料：恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml离心管，50ml离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽，梳子，锥形瓶，离心机。菌体：E.coliDH5a受体菌，具有Ampr标记的质粒DNApUC19.实验试剂及其理化作用：LB培养液，抗生素溶液Ⅰ（50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0）：葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA是阳离子螯合剂，抑制DNase的活性。溶液Ⅱ（0.2MNaOH/1%SDS）：使细胞破裂，使质粒DNA与染色体DNA同时变性。溶液Ⅲ（3M醋酸钾/2M醋酸）：这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀。加醋酸中和使溶液呈中性，使变性的质粒DNA复性，但不能使染色体DNA复性。RNase酶母液，TE缓冲液（10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)），饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。遇冷无水乙醇，70%乙醇，TAE电泳缓冲液，上样缓冲液（6×），琼脂糖，溴化乙锭(EB)，DNA相对分子质量标准物DNAMarker,醋酸钠。实验步骤1、质粒的提取EcoliDH5α（PUC19）→LB+AP平板划线→37℃，16-18hr→单菌落→LB+AP(80ml)→37℃,O/N→LB+AP(80ml)→37℃，4-6hr→称管重W1,约30ml菌液→10000rpm,1min→去上清，加5mlⅠ,涡旋→10000rpm,1min→去上清，吸干净→称重W2→2mlⅠ,涡旋，冰浴5min→4mlⅡ,颠倒摇匀，冰浴5min→3mlⅢ,缓慢摇匀，冰浴5min→12000rpm,10min→转上清至新管→2V冰乙醇，匀，-20℃，30min→12000rpm,15min→去上清→2ml70%乙醇清洗→10000rpm,1min→去上清→70%乙醇清洗→10000rpm,1min→去上清→37℃,5-10min→1mlTE溶液→2μlRNase(50μg/μl),37℃,2、纯化及电泳两份完全一样的500μl粗提物→加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V1）→加等体积（V1）酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V2）→加等体积（V2）酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V3）→加1/10V33MNaAc+2V冰乙醇→取沉淀→-20℃,30-60min→12000rpm,15min→弃上清→500μl70%乙醇→12000rpm,5min→弃上清→500μl70%乙醇→12000rpm,5min→吸净上清→37℃,5-10min→两管25μlTE溶液→50μl/组→得纯化质粒DNA。40ml×TAE→300ml锥形瓶→称0.4g琼脂糖→微波炉沸腾3次→50-60℃→倒板成型取3μlDNA+1-2μl6×loadingBuffer→混匀→点样→100V，电泳，40min→EB染色10min→水洗10min→紫外成像→分析注意事项：1，提取过程应尽量保持低温。注意离心机的使用，离心管要配平，以防错误操作损坏离心机。离心结束后，将离心管从离心机中取出时应保持其倾斜状态，防止沉淀重新进入上清液中。2，溶液2要现用现配，以保证NaOH没有吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。3，溶液2处理即变性时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片段会慢慢断裂。4，加上溶液2之后混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA。5，沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。时间不宜太长(限20min内)。沉淀离心后，需用70％乙醇洗涤，以除去盐类及挥发性较小的异丙醇。6，酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。7，应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会暴沸蒸发，影响琼脂糖浓度。8，制胶时要除去气泡。9，拔梳子时要特小心，以防凝胶与支持物脱离。10，上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。11，溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有EB的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，实验结束后用水彻底冲洗干净。实验现象及结果分析1，W1=12.716g,W2=12.876g,菌重W2-W1=0.160g。2，加入溶液Ⅰ后，将离心管盖好后放于旋涡振荡器上振荡，无白色菌体块状物悬浮在液体中，即已振荡均匀。3，加入溶液Ⅱ时，要逐滴缓慢加入，边加边轻轻摇动离心管，可观察到离心管中液体呈粘稠的蛋清状无白色菌体块存在。溶液Ⅱ为强碱性溶液，可以使细胞破裂，质粒DNA和染色体DNA变性。4，加入溶液Ⅲ并离心后出现白色絮状沉淀。因为溶液Ⅲ为高盐溶液，调节碱性溶液至中性，使变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成白色絮状沉淀。5，用饱和酚氯仿抽提是试管底出现大量白色沉淀。6，加入无水乙醇离心后离心管底出现少量的沉淀。加入ET溶液后管底沉淀物溶解。我们组的电泳条带图1质粒DNA电泳条带1，从胶的左边开始，各条带分别是：（1）DNAmarker，DL-5000（2—13）各组提取的质粒DNA条带，（14）PUC19，(15)λDNA2，箭头所标记的是我们组的电泳条带。从上到下依次是：蛋白质，染色体DNA杂带，开环质粒DNA带，线形质粒DNA带，超螺旋质粒DNA带（主带），RNA带。3，用我们组实验所得的电泳条带与第14条带，即标准的PUC19带型和DNAmarker比较可以看出，我们提取到超螺旋质粒DNA条带清晰含量较多。开环质粒DNA和线性质粒DNA的电泳条带不清晰，因此样品中含有少量染色体DNA及线形和环状DNA.蛋白质带较浅,说明大部分蛋白质杂质已被抽提掉。RNA条带较浅，说明RNA含量并不多，大部分RNA被RNase降解除去。我们组本次实验中所提取的质粒DNA，与100ng/ul的纯pUC19质粒相比较,含量大约有200—300ng/ul。蛋白质,DNA杂带，RNA等杂志相对较少。说明我们虽然在提取过程中存在一些失误，在去上清过程中没有用移液器吸出而是直接倒掉留下了较多的杂志，使得粗提取的质粒DNA中含有较多的蛋白质杂质，但是经过纯化过程已经把大部分的蛋白质杂质抽提掉除去。实验原理：从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可利用分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。碱基性法抽提效果良好，既经济且得率较高。抽提到的质量DNA可用于酶切、连接和转化。对于分子量较大拷贝较少对的质粒DNA，由于DNA片段较大易于损伤断裂，因此选用吕华铯密度超高离心法抽提DNA，且具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质量DNA是超螺旋构型等特点。对于高拷贝数质粒，用少量制备法抽提质粒DNA就有足够量可用于基因操作。碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在PH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以PH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其PH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。本实验就是利用碱变性抽提大肠杆菌中的质粒。loadingbuffer的中文名字叫上样缓冲液,6*的缓冲液中可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。loadingbuffer的功能主要有两个。第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止