质粒DNA的提取纯化及验证

质粒DNA的提取、纯化及验证姓名：肖风学号：2010001001222010级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。2、掌握质粒DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。2、琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(EB)或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至20Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学实验中，常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：(1)样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与相对分子质量(所含碱基)的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。(2)DNA分子的构象：相对分子质量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)的一条链断裂，变成开环DNA(opencircleDNA，oeDNA)分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA(1inerDNA，LDNA)分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。(3)琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。(4)电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度DNA泳动的增加程度不同，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V／cm。(5)缓冲液：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。当电泳液为去离子水(如不慎误用去离子水配制凝胶)，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下(如错用10×电泳缓冲液)，导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。(6)温度：琼脂糖凝胶电泳时，不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在4～30℃内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0．5％时，凝胶很脆弱，最好在4℃下电泳以增加凝胶强度。三、【实验材料】恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡仪，水浴锅；1.5mL离心管，50mL离心管，不同型号的吸头，微量移液器等。菌体：E.coliDH5α受体菌，具有Ampr标记的质粒pUC19微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf管，刀片，塑料薄膜等。酶切后的DNA样品或其他待分离纯化的DNA样品；琼脂糖，TAE缓冲液，溴化乙锭（EB），6×上样缓冲液，DNA相对分子质量标准物DNAMarkerλ/HindIII，5mol/LpH5.2的醋酸钠，无水乙醇。四、【实验步骤】（一）、实验前准备1、LB培养液+1%葡萄糖按照附录所示配方配制LB培养液，并添加1%葡萄糖，115℃灭菌30min，分别分装于100mL锥形瓶中20mL，300mL锥形瓶中50mL；同时配制固体培养基用于活化菌株。2、枪尖：1000μL（蓝色）、200μL（黄色）、20μL（白色），灭菌备用3、离心管：1.5mL离心管于500mL锥形瓶中，50mL离心管2支，灭菌备用4、吸管：10mL吸管，灭菌备用（二）、质粒提取1、细胞培养在含有氨苄青霉素的LB平板上挑去携带有质粒pUC19的E.coli单菌落，接种于20mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将过夜培养液吸取2—3mL接种到50mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养4—6h，即到达菌体生长的对数晚期。2、质粒提取2.1.取30mL菌液于50mL灭菌离心管中，在7000r/min条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体细胞。空管质量为15.570g。2.2.向离心管中加入5mL冰箱预冷的溶液Ⅰ，加入溶液I主要是为了打散菌体，使菌体沉淀转变成为均匀的菌悬液，为下一步破碎菌体做准备，可剧烈振荡，此时细胞尚未破裂，不用担心染色体断裂。为节省时间，可在漩涡振荡仪上混匀。通过步骤（1）离心，弃去上清液，将离心管倒置，使上清液全部流尽，用吸水纸擦干，称量菌体质量，为15.742-15.570=0.172g。2.3.按湿菌体质量：溶液I体积=100mg：1mL的比例加入用冰箱预冷的溶液I（2mL），剧烈振荡，使细菌完全分散，将离心管置于碎冰中冰浴5min2.4.以2倍体积加入新配制的溶液Ⅱ（4mL），轻摇轻加，至半透明溶液形成。此步是DNA变性的关键步骤，加入溶液II后，菌悬液pH上升到12左右，为强碱性，破坏大肠杆菌（G-）细胞壁，此时，溶液变粘稠、透明，无菌块残留，因为染色体DNA与质粒DNA均变性溶解于强碱溶液中，蛋白质也溶于溶液中，但质粒DNA双链不完全分离。因此步染色体DNA释放，故动作必须轻柔，不能剧烈震荡，否则染色体DNA会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解于溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。可缓慢上下颠倒离心管数次，既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。2.5.以1.5倍溶液I体积量加入冰箱预冷的溶液Ⅲ（3mL），轻加轻摇，慢慢颠倒数次，使之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上10min，此时有白色絮状沉淀物。此步是质粒DNA复性的关键步骤。动作要轻柔，理由同上。同时可减少对质粒DNA的破坏，使其保持超螺旋闭环结构。2.6.12000r/min离心15min，将上清液轻轻转移到另一洁净离心管中，向上清液中加入1/10体积的3mol/mL的NaAc和2倍体积的冰无水乙醇，混匀，-20℃下静置30min，沉淀DNA。2.7.如（6）中离心15min，小心弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上，以使所有的液体流出。2.8.向沉淀物中加入70%乙醇3mL，不打散沉淀洗涤一遍。12000r/min离心5min，弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上，室温干燥。2.9.将DNA沉淀溶于1mLTE缓冲液中，加入RNaseA（终浓度大于50μg/mL）。37℃保温0.5—1h。3质粒DNA的纯化3.1.将上述DNA溶液平分在2个1.5mL的微量离心管中，每管0.5mL，分别加入等体积的Tris饱和苯酚溶液，混匀，7000r/min离心5min，取上层清液到另一洁净微量离心管中。离心后，苯酚位于离心管的最下方，蛋白质层位于中间，溶解有质粒DNA的水层位于最上方。离心管从离心机里取出后，尽量减少晃动，以免蛋白层污染DNA水溶液，使分界面模糊、不清晰，不利于下一步分离。使用苯酚等有腐蚀性的有机溶剂时，一定要戴橡胶手套，注意安全。一旦皮肤被苯酚等污染，立即用大量水清洗。3.2.加入等体积苯酚:氯仿（1:1）混合液，混匀，7000r/min离心5min，取上层清液到另一洁净微量离心管中。3.3.加入等体积氯仿溶液，混匀，7000r/min离心5min，取上层水相到另一洁净微量离心管中。3.4.加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/LNaAc溶液，混合均匀，于-20℃沉淀0.5h以上。沉淀质粒DNA可采用无水乙醇，需在低温条件下静置。由于细胞裂解时同时释放出一些酶类，低温条件可保证DNA水解酶类保持在低活性，以减少其对DNA的降解。用70%的乙醇洗涤质粒DNA沉淀，主要目的是利用乙醇中的水分溶解残余盐类等杂质。在加入RNaseA前洗涤去盐类，可保证酶活不受其影响。3.5.12000r/min离心15min，收集沉淀，弃去上清液并干燥。3.6.在沉淀DNA中，加入70%乙醇200μL，不打散沉淀洗涤一次，12000r/min离心1min，小心弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上使所有的液体流出，室温干燥。3.7.用50μLTE溶液重新溶解DNA，温和震荡几秒钟，备用。溶解沉淀时，为获得最大量产品，应逐滴加入溶剂，边加边摇；尽量少转动离心管，避免过多样品粘于壁上导致损失。4DNA纯度检测（0.9%琼脂糖凝胶电泳法）4.1.制板4.1.1.称量0.36g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入40mL1×TAE缓冲液，在微波炉中加热，使琼脂糖融化。4.1.2.待凝胶温度降至大约55℃以下（手持瓶子不烫手，即感觉热但能握得住）。4.1.3.在模具上插入一个合适的梳子形成加样孔（如果待回收的DNA体积较大时，可用透明胶带将几个相邻的梳齿封住，使之形成较大的孔）。梳齿的位置应在托盘底面上0.5~1.00mm，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。4.1.4.将凝胶倒入准备好的制胶模具中，等凝胶完全冷却凝固后变成乳白色不透明状（月30min），将梳子轻轻拔出。4.1.5.用拇指和食指轻移胶版两侧，将凝胶体放入加有TAE缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶表面。4.2.电泳4.2.1.取3μL质粒样品+1μL电泳载样液，在塑料薄膜上用微量移液管吹吸混匀，加入到凝胶孔中，枪尖应没入液面但在凝胶面上方正对点样孔处。吹洗法混匀少量液体时需注意避免产生气泡，增加操作难度和误差。用微量移液器吸进液体时应该小心，避免产生气泡；吹出液体时，不要将液体从针尖口完全吹出，要留一滴在针尖口处，可预防气泡的产生。同时，溶解沉淀时，针尖应该在沉淀的最高处吹吸，可使沉淀慢慢溶解，不至于损失。注意，在塑料薄膜上混匀buffer和DNA样品时，枪尖不要太倾斜，以免吹走液滴。4.2.2.取适量上样缓冲液和一定量的待分离纯化的DNA样品（如酶切产物、