质粒DNA的提取鉴定

实验三质粒DNA的提取鉴定一、原理质粒是细胞质中独立于染色体之外的能自主复制的遗传单位。基因工程中的质粒一般是指细菌质粒，它可以随着细菌的细胞分裂将自己的遗传特性稳定的遗传给后代细胞。广义的质粒还包括霉菌、蓝藻和酵母质粒以及动植物细胞中的线粒体和质体等。细菌质粒是环状双链DNA分子，其他少数质粒是线性DNA分子，而酵母的杀伤质粒则是RNA。环状质粒的DNA分子具有超螺旋性质，长度可以从1kb到200kb左右不等。质粒中除了复制、转录等相关的必需序列外，有一些DNA区段对于细菌来说并非必需序列，通过体外操作以目的基因取代这些非必需区段，这种改造的质粒就成为外源基因载体。按照质粒载体的用途和其外源DNA的遗传信息能否表达可分为中间克隆载体（如pMD18-T）和表达载体（如pET-X、pBI121等）。克隆载体所连接的的DNA片段一般没有启动子，因而不能转录，主要用于目的片段的大量制备。表达载体按照宿主的不同有各种各样的原核表达载体（如大肠杆菌）和真核表达载体（如酵母、动物和植物），目的基因在载体上有完整的启动子和终止子调控，可以在宿主细胞中转录并翻译成蛋白。根据质粒在宿主细胞中复制调控机制的不同，可分为两类：一类是“松驰型”质粒，如pMB1/colE1复制子，其复制受到一种称为RNAII的分子正向调控，不需要任何质粒编码的蛋白质，完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质，因此即使在氨基酸饥饿或添加氯霉素等抗生素抑制蛋白质合成的条件下，其复制仍不停止，即所谓的“松驰”方式复制，其在宿主细胞中拷贝数较多，一般如常用的pUC系列可达500～700个；二是“严紧型”质粒，如pSC101，其复制伴随着RepA蛋白的合成，因此一旦蛋白质合成受阻，其拷贝数就不能增加，即在宿主的“严紧”控制下复制，其在宿主细胞中拷贝数通常仅有1~5个。在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用的是“松驰型”质粒；但在某些特殊原因（如表达产物对细胞有毒性）下要求用严紧型质粒。图2质粒DNA图谱质粒DNA的分离提取主要有三个步骤：①宿主细胞分离或快速繁殖。质粒DNA常以酵母或细菌为宿主细胞。在一定培养条件下，酵母或细菌生长呈S形曲线，一般认为，处于对数生长晚期的细菌细胞壁容易裂解，质粒DNA提取效率高。对于常用的pUC系列质粒，由于其复制调控机制上的原因，细菌在37℃或42℃下培养，其拷贝数较多，30℃时，拷贝数会大大降低②细胞的收集和裂解。通过低速离心可以将培养液中的菌体收集起来。收集的菌体通过一定物理（如超生波）或化学方法（如强碱、变性剂）处理使细胞裂解，从而可以将胞内的质粒DNA释放出来。酵母细胞裂解比细菌要困难一些。③质粒DNA的纯化。借助物理（如密度梯度离心）和化学（碱法）的方法将质粒DNA以外的细胞壁、染色体DNA、RNA和蛋白质等杂质去除，可以获得纯的质粒DNA。细菌裂解常利用去污剂（如SDS）和变性条件（如高温、强碱）使细菌细胞壁和细胞膜裂解，释放出细胞内容物，溶菌酶预处理有助于提高细胞壁的裂解效果（作用于细胞壁肽聚糖）。然后根据变性的染色体DNA和质粒DNA由于拓扑学特征的不同，造成的复性热力学特征不同，将其分开。在碱性条件下，变性的染色体DNA和破裂的细胞壁、细菌蛋白等缠绕成大型复合物，并被SDS包盖，复性缓慢，当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中沉淀出来，而闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开，当条件恢复正常时，迅速复性，形成天然的超螺旋分子，因此可通过离心技术将两种类型的DNA分开。质粒DNA的纯化经典的方法有碱法和氯化铯-溴乙啶密度梯度离心。通过氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心直接将蛋白质、缺口环行或线性DNA、封闭环行质粒DNA和RNA分离开来。碱法利用聚乙二醇（PEG）沉淀核酸，LiCL选择性沉淀去除大分子RNA，RNaseA消解小分子RNA，再用苯酚、氯仿等蛋白变性剂结合离心将溶液中的残余蛋白质沉淀出去。溶液状态的质粒DNA用有机沉淀剂（乙醇、异丙醇）或结合无机沉淀剂（NaAc、NH4Ac等）就可以沉淀出来。其他纯化方法还有电洗脱法、羟基磷灰石柱层析法，Sepharose2B凝胶过滤法等。影响质粒DNA产量的因素主要有寄主菌株遗传背景、质粒拷贝数和分子大小。大肠杆菌质粒DNA分子自然状态下是共价闭合环状DNA（cccDNA）。但在DNA提取过程中，由于细菌正处于对数生长期，加之提取过程是在剧烈裂解条件下进行，提取到的DNA一般可能包括以下几种构型：超螺旋（scDNA，复制完成）、套索DNA（复制进行中）、开环DNA（ocDNA）、线性（LDNA）等，在琼脂糖电泳中由于泳动速率不同可以观察到多条电泳谱带，谱带的先后顺序、相对距离主要决定于构型（scDNALDNAocDNA套索DNA），同时还受操作过程和凝胶中溴乙锭浓度的影响。二、材料、仪器和试剂1．材料大肠杆菌DH5α（含质粒pUC）2．仪器三角瓶、离心机（离心管）、量筒或移液管、微量移液器、天平、电泳装置3．试剂LB培养基1000mL酵母粉5g胰蛋白胨10gNaCl10g调节pH值为7.05×磷酸母液100mlKH2PO411.56gK2HPO3.3H2082.19g。1MTris.HCL(pH8.0)100mlTris碱12.1g水80ml用浓HCL调pH,HCL用量为pH=7.47ml7.66ml8.04.2ml（应使加入HCL后的溶液冷却至室温再最后调准PH值）0.5MEDTA(pH8.0)100mlNa2·EDTA:18.61g水80ml用NaOH（约20g）调PH=8.0，定容后高压灭菌。10%SDS100mlNa-SDS10g水800ml68℃搅拌溶解,定容100ml,用HCL调pH=7.21号溶液100ml葡萄糖(Glucose)0.9g1MTris-HCL(pH8.0)2.5ml0.5MEDTA(pH8.0)2.0ml高压灭菌后置于4℃保存。2号溶液100ml10NNaOH2ml10%SDS10ml用前配制，但提前配好10N的NaOH母液及10%SDS母液。5MKAC（pH5.2）100mlKAC49.07g先用少量水溶解，再用冰醋酸调pH=5.2，定容100ml3号溶液（3M醋酸钾pH5.5）100ml醋酸钾(5M)60ml冰乙酸11.5ml定容为100ml，保存于-20℃的冰箱内。5MLiCl100mlLiCl·H2O30.25g定容至100ml后，高压灭菌,储存于-20℃。STET100mlNaCL0.6g1MTris.Cl(pH8.0)1ml0.5MEDTA(pH8.0)0.5mlTriton5mlTE缓冲液（pH8.0）100ml1MTris.Cl(pH8.0)1ml0.5MEDTA(pH8.0)0.5ml灭菌保存，备用。RNA酶处理RNA酶溶于10mMTris（pH7.5）、15MmNaCl溶液,使酶浓度为10mg/ml，沸水煮15—20分钟，慢慢冷却至室温,分装后于-20℃保存。1.6MNaCl(含13%PEG)100mlNaCL9.35gPEG16.28g10MNH4Ac100mlNH4AC77.08g定容100ml，过滤灭菌室温保存（低于23℃结晶！）0.01MNaAc(pH5.2)1000mlNaAc.3H2O1.36g水800ml用冰醋酸调pH=5.2，定容。三、操作步骤方法一大肠杆菌质粒DNA的大量提取(碱法)1．将含有质粒的大肠杆菌在LB液体培养基(含适量抗生素)中37℃培养16-20小时。2．用含抗生素的LB培养基繁殖大肠杆菌37℃，250rpm，震荡培养16小时左右。3．悬浮菌液移至大离心管内，每管500ml，4℃下6000rpm离心15分钟,弃上清。4．用“1号溶液”(18ml/管)回溶菌块(摇床上慢摇10分钟)，确保菌块全部回溶。5．加2ml浓度为10mg/ml的溶菌酶(溶在1号溶液内)，室温下放置10分钟。6．加40ml冷的“2号溶液”混匀，室温下放置10分钟(此时菌液应变清)。7．每管加20ml冷的“3号溶液”，充分混匀（不再分两个液相），在冰内放置10分钟，并摇动混合3次，(此时细菌的染色质应沉淀下来)。8．4℃下9000rpm，离心15分钟。如染色体DNA未完全沉淀，重复离心，直至大分子DNA沉淀全部清除为止。9．取上清，加0.6体积的异丙醇，混合后置室温下10分钟。10．室温下8000rpm离心15分钟（不要4℃离心，否则盐会沉淀！）。取沉淀用70%乙醇洗二次，倒置离心管干燥。11．DNA回溶在TE内（每500ml菌液加3ml），混合后室温下30分钟（此步可停）。12．将溶解后的提取物移至15-30ml的离心管内，加等体积（3ml）冷的5MLiCl，混合后置冰上2-5分钟。4℃下10000rpm离心10分钟（沉淀大分子RNA）。13．将上清移至干净的离心管内（30-50ml的离心管），加等体积的异丙醇，混合均匀，室温下沉淀5-10分钟（摇两次）。室温下以10000rpm离心10分钟。14．倒掉上清，倒置离心管以除去残余的上清。用70%乙醇洗2次（室温），倒置离心管干燥几分钟蒸发乙醇。15．沉淀溶于500l的TE，加RNA酶A（终浓度为20g/ml），将混合液移至1.5ml的小离心管内，室温下置30分钟。16．加500l的1.6MNaCl(含13%的PEG8000)，混合均匀。置冰上2-5分钟，于4℃下12000rpm离心5分钟(回收质粒DNA)。小心倒掉上清，将沉淀溶于400l的TE中（此步可省略！）。17．用等体积的苯酚/氯仿异戊醇(25:24:1V/V)抽提1次，取上清液，再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。18．将上层液小心吸出，置于干净的1.5mL离心管内。加100l的10MNH4Ac溶液，混合。再加2倍体积（约1ml）的无水乙醇，室温下置10分钟。19．于室温下12000rpm离心5分钟。20．小心吸去上清。加200l的70%乙醇（4℃），振荡几秒钟后，室温下12000rpm离心5分钟。重复一次，倒置离心管使乙醇蒸发（勿倒掉DNA沉淀！）。21．将沉淀溶于500l的TE。取少量用TE稀释50-1000倍，测OD260，算出质粒DNA的浓度（1OD260=50g质粒DNA/mL）。保存于-20℃内待用。方法二大肠杆菌质粒DNA的微量提取（煮沸法）1．将含有质粒的大肠杆菌（农杆菌）接种于含抗生素适量LB（YEP）培养基中，37℃（28℃），200rpm震荡培养至对数生长期。2．取1ml菌液至1.5ml的离心管中,12000rpm，离心1分钟。3．去上清,用80µlSTET缓冲液悬浮菌体。4．加入4l溶菌酶（10mg/ml）。5．沸水中煮1分钟。6．立即取出，室温下12000rpm离心10分钟。7．用牙签将底部沉淀完全挑出，保留上清。8．加入80μl冷的异丙醇混合均匀。9．12000rpm，离心5分钟，沉淀DNA。10．小心倒掉上清，沉淀用70%乙醇洗2次，倒置干燥。11．回溶于20lTE中，取3l用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。方法三大肠杆菌质粒DNA的微量提取（碱法）1．将含有质粒的大肠杆菌按5%量接种到液体5mLLB培养基(含适量抗生素)内培养至对数生长晚期(一般0D600=0.6)。2．悬浮菌液移至1.5mL离心管内，室温下4000rpm离心15分钟，弃上清。若沉淀较少可重复收集1~2次。3．用200µL“1号溶液”回溶菌块。4．加400µL新配置的“2号溶液”，颠倒混匀(不剧烈震荡)。5．每管加入300µL冷的“3号溶液”，充分混匀，在冰内放置5分钟，并摇动混合3次。6．12000rpm离心5分钟。如染色体DNA未完全沉淀，重复离心，直至大分子DNA沉淀全部清除为止。7．取上清，加0.6体积的异丙醇，混合后置室温下10分钟。8．室温下12000rpm离心5分钟。9．沉淀用70%乙醇洗二次，倒置离心管干燥，沉淀用70%乙醇洗两次后，溶于20-50L的TE备用。方法四小量柱法试剂盒提取质粒DNA（OmigaCo.）1．将含