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质粒质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到HindIII、BamHI或SalI切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10kb(kb表示为千碱基对)。复制原点DNA复制起点，即DNA聚合酶结合位点标记基因一般是运载体上的一段特殊DNA序列，能表达特定形状便于检测运载体是否导入受体（如抗氨苄青霉素基因，绿色荧光基因）启动子转录起始位点，即RNA聚合酶结合位点终止子转录终止位点，也是特殊的DNA序列起始密码子（无启动密码子之说）mRNA上翻译起始的位置，通常为AUG，对应甲硫氨酸，少数细菌（属于原核生物）以GUG(缬氨酸)或UUG为起始密码，线粒体和叶绿体以AUG、AUU、AUA为起始密码子终止密码子翻译终止位置，不对应氨基酸，为UAA,UAG,UGA目的基因插入运载体，就是想要使其表达的那一段DNA序列，比如说想将人生长激素基因导入到小鼠体细胞中使其表达，那么人生长激素基因就是目的基因，经限制性内切酶切后与运载体相连（运载体新教材上为载体）1.质粒转化具体操作步骤：将1ul质粒DNA加入1.5ml的离心管；将感受态细菌（competentcells）从－70℃冰柜中取出，快速吸取50ul感受态细菌，加入含质粒DNA的1.5ml的离心管；轻轻地旋转以混匀内容物，在冰中放置30～60min；42度热休克90s（该时间应该非常准确，用Timer记时），冰上放置5min；每管加500ulLB培养液，放37℃水浴1h；吸取200ul培养物至含相应抗生素的90mmLB平板上，涂布棒将培养液涂布均匀；倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。2.质粒的抽提具体操作步骤：用前将RNaseA管的液体全部加到SolutionⅠ（加好RNaseA的溶液I一般储存在4℃）；将60ml的乙醇加到洗涤缓冲液瓶37℃培养16h的平板中挑取一个单菌落（直径2～3mm），接种到10mlLB培养液37℃剧烈振摇培养16h；取4ml菌液到5ml离心管，8000rpm室温离心3min；去上清，放于面巾纸上吸干痕液，加250ulSolutionⅠ（注意用前应该加RNaseA管），于涡旋振荡器重悬细胞；加250ul37℃预热2-3min的SolutionⅡ；加350ulSolutionⅢ，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次；将5ml离心管中的溶液倒入1.5ml离心管中，室温孵育2-3min，12000rpm4℃离心15min；装配2ml收集管（白色）和柱状收集管（蓝色）将上清倒入柱状收集管（蓝色）中；8000rpm室温离心3min；去掉收集管中的液体，加500ulBufferHB到柱状收集管中，10000rpm室温离心1min；去掉柱状收集管中的液体，加750ulWashBuffer（注意用前加乙醇），10000rpm室温离心1min；重复上述步骤一次；不加WashBuffer将管子10000rpm室温离心1min；将柱状管放到一个消过毒的1.5ml离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm室温离心3min洗提（洗脱）DNA。3.质粒电泳具体操作步骤（以倒20ml的胶为例）：用50ml量筒量取20ml1XTAE；用电子天平称量0.16g琼脂糖，并倒入20ml电泳缓冲液中；将称量纸覆盖在装有琼脂糖的电泳缓冲液的三角瓶中，放入微波炉中转1min30s，至肉眼看不到颗粒状琼脂为止；至室温待溶液冷却至60度左右，将三角瓶中溶液倒入制胶盒中，并加入上样梳子；至室温约30min胶凝固后，拔掉梳子并将凝胶安放到电泳槽内；向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm；将样品中加入适量的10X上样缓冲液，该上样缓冲液的体积计算如下：如果样品体积是20ul加入2ul10X上样缓冲液，如果是30ul，加入3ul10X上样缓冲液；将样品加入上样槽中，打开电源，一般为120v，电泳约20-30min，关掉电源，在DarkReader荧光透射仪观察结果。质粒(Plasmid)质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)。许多细菌除了拟核中的DNA外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)（补充：部分质粒为RNA）。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到HindIII、BamHI或SalI切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10kb(kb表示为千碱基对)。（1）高拷贝数的质粒载体适于分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片段。如ColE1、pMB1或它们的派生质粒。它们不仅具有低分子量、高拷贝数的优点，而且在没有蛋白质合成的条件下仍能继续复制。因此，若在处于对数生长晚期的含有ColE1一类质粒的大肠杆菌培养物中，加入适量的蛋白质合成抑制剂讲如氯霉素或壮观霉素处理之后，每个细胞中的质粒拷贝数则可扩增到1000～3000个之多。如果加入高浓度的尿核苷，质粒DNA又可进一步扩增2～3倍。（2）低拷贝数的质粒载体适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的DNA。例如，pLG338、pLG339及pHSG415。这类质粒载体的一个普遍性问题是，由于它们体积小、拷贝数低，与此相应的基因剂量也就较少，因此要制备大量的克隆DNA就很困难。（3）失控的质粒载体失控的质粒载体（runawayplasmidvectors）：是一些低拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。B.E.Uhlin等人（1979）首先发展了失控的质粒载体pBEU1和Pbeu2。这种质粒载体在30℃下，每个寄主细胞中只含有适量的拷贝数，而当培养温度超过35℃时，质粒的复制便失去了控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。这期间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长受到了抑制，并失去了存活的能力，但在这个阶段质粒DNA可累积到占细胞总DNA的50%。（4）插入失活型的质粒载体选用插入失活型质粒，将外源DNA片段插入在会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度地提高获得阳性克隆的几率。除了pDF471和Pdf42之外，都具有基因插入失活的克隆位点，因此都属于插入失活型的质粒载体。（5）正选择的质粒载体正选择质粒载体（directselectionvectors）：这种质粒载体具有具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻了实验的工作量，提高了选择的敏感性。（6）表达型的质粒载体使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的转录-转译信号控制之下，并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expressionvectors）。它分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种不同的类型。质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的质粒虽然都是环状构形，然而目前也发现有少数的质粒属于线性构形，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。目录简介质粒在细胞内的复制质粒载体质粒的不兼容性从细菌中提取质粒的方法从细菌中分离质粒DNA的具体操作材料、设备及试剂操作步骤特征展开简介质粒在细胞内的复制质粒载体质粒的不兼容性从细菌中提取质粒的方法从细菌中分离质粒DNA的具体操作材料、设备及试剂操作步骤特征展开简介质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DN