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实验五质粒DNA的提取鉴定掌握碱变性法从大肠杆菌中提取质粒DNA原理和方法。掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。一、实验目的质粒（plasmid）是一种独立的稳定的遗传因子，存在于细菌等细胞中。它们为双链、闭环的DNA分子，大小从1kb到200kb不等，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的DNA基因信息，但其复制和转录要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，而宿主在没有质粒时是可以正常生长的。因此，质粒是一种寄生性的自主复制子。细菌质粒是基因工程中常用的基因载体，也是分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达的好材料。二、实验原理碱变性抽提法法是常用的方法之一.此法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的Kac高盐缓冲液调节pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。二、实验原理抽提中各种因素的影响，质粒DNA可能以三种形式存在：1.共价闭环DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA），常以超螺旋形式存在；2.开环DNA（opencircularDNA，ocDNA），此种质粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，形成缺刻，可以自由旋转从而消除了张力，形成松弛的环状分子；3.线状DNA（linearDNA，lDNA），质粒DNA的两条链在同一处断裂所形成。在电泳时，同一质粒DNA的泳动速度根据迁移率从小到达分别为开环，线形和超螺旋DNA。cccDNA含量越高，表明制备的质粒DNA质量越好。三、操作步骤1.取2ml细菌培养液于2mlEppendorf离心管中，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清（将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体尽可能流尽），保留菌体沉淀。2.沉淀悬浮于100ul预冷的试剂Ⅰ（TEG缓冲液）中，混匀（置混合器振荡），冰上置10min。3.加入新配制的试剂Ⅱ（碱裂解液）200ul，加盖，轻轻颠倒3～4次，冰上置10min。4.加入预冷的试剂Ⅲ（乙酸钾溶液）150ul，盖紧管盖，颠倒数次，冰上置10min。12000rpm，4℃，离心10min，以除去细胞碎片及大部分细菌染色体DNA。5.上清液移入另一干净离心管中，加入等体积的平衡酚轻摇，12000rpm，4℃，离心10min。6.取上层水相置于另一离心管中，加入等体积的氯仿（氯仿：异戊醇=24：1）抽提，12000rpm，4℃，离心10min。7.取上层水相置于另一离心管中，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，混匀后置—20℃过夜（至少要放置2h以上）。8.12000rpm，4℃，离心10min，弃上清，将管口倒置于纸巾上使所有液体尽可能流出。9.加入1ml70%乙醇洗沉淀一次。12000rpm，4℃，离心10min。10.弃上清，将管口倒置于纸巾上使液体流尽，放置干燥或真空干燥，即得质粒DNA制品。11.将沉淀溶于20ulTE缓冲液，（临用前加入1u或20ug/mlRNaseA）待用。50mM葡萄糖25mMTris-HCl10mMEDTA-Na2200mMNaOH1%（W/V）SDS3MNaAC省去25min30min以上实验步骤不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带。核酸构型不同，在凝胶中的电泳速度差别较大。同一质粒DNA的泳动速度次序为：共价闭环DNA＞开环DNA＞线状DNA。溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在波长254nm紫外光照射下插入溴化乙锭的DNA显橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。四、DNA的琼脂糖凝胶电泳原理1.琼脂糖凝胶的制备：本实验采用1.0%的琼脂糖凝胶。称取0.3g琼脂糖放入锥形瓶，加入30ml电泳缓冲液，置于微波炉使其充分融化。室温放置至60℃左右，加入EB使其终浓度为0.5ug/ml，混匀，倒胶板（30ml/板）。2.凝胶板的制作：用1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两端边缘围成高4mm的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的模板置于水平台上，迅速将上面胶液倒在模板的中央，让胶液自由流向四周。待胶液充分冷却凝固，将胶纸围墙慢慢取下，制备好的凝胶板放入电泳槽中，加电泳缓冲液直至没过胶面约1mm深，取出样品梳。五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤3.加样：10ulTE溶解+4ul上样缓冲液，取10ul点样4.电泳：电压：120V电泳时间：45min电泳终止：指示剂距离凝胶前沿约1cm处5.检测：取出胶板，用紫外检测仪观察结果。纯的质粒DNA只有超螺旋DNA一条带。6.凝胶处理：鉴定后的凝胶应放在指定的地方，待干燥后烧毁，不能倒在垃圾中，以防EB污染。五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤六、实验报告要求一、原理二、操作三、结果（铅笔绘图：正负极，条带数目、名称、强弱、距离）四、结果说明五、思考题1、分离提取DNA的过程中哪些因素会引起链的断裂?2、本实验为了质粒DNA纯度和分子的完整性，采用了哪些措施？