质粒转染后luciferase检测操作手册

1/4质粒转染后luciferase检测操作手册实验流程描述培养生长状态良好的293T细胞，质粒转染前一天将细胞分入24-well培养板培养，转染当天按实验设计的组别进行质粒转染实验。转染24小时后荧光显微镜下观察细胞内荧光标记基因（如GFP）的表达情况，然后使用“Dual-Glo™LuciferaseAssaySystem（E2920，promega）”试剂盒处理细胞、进行luciferase表达检测。实验材料：试剂试剂名称试剂来源cat.No.胎牛血清FBSGIBCODMEMGIBCO胰酶上海化学试剂公司Opti-MEMInvitrogenDual-Glo™LuciferaseAssaySystempromegaE2920仪器仪器名称仪器来源cat.No.2/4荧光显微镜奥林帕斯micropublisher3.3RTVCO2培养箱日本三洋SANYOMCO-175生物安全柜上海振样创空气净化设备公司Bio1200-Ⅱ-A2酶标仪睿星公司提供实验步骤：1.准备目的细胞1.1细胞复苏1)从液氮罐中取出细胞冻存管2)迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻3)完全解冻后，1000rpm，离心2min4)75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台5)吸去冻存液上清，加入1ml新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3ml完全培养基的6-cmdish中，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2培养箱培养6)次日更换一次培养液后再继续培养1.2细胞传代1)将生长至90%汇合的细胞进行传代2)弃去旧培养液，加入2ml灭菌的D-Hank’s溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶液3)加入1ml胰酶消化液，37℃消化约1-2min，直到细胞完全消化下来4)加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来5)混匀细胞后分至两个新的6-cmdish中，补足完全培养基至4ml，继续培养2.目的细胞质粒转染3/41)将处于对数生长期的293T细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液2)将细胞悬液（细胞数约为4×105）接种于24-well培养板中，37℃、5%CO2培养箱培养至细胞融合度达到约80%3)根据invitrogenlipofectamine2000转染试剂使用说明书进行转染操作：a)将培液换成400µl的opti-MEM培养基b)每孔转染1µg质粒、需要2µllipofectamine2000，按照此比例，将质粒和lipofectamine2000分别溶解于opti-MEM中，混匀，室温静置5minc)将b)中稀释好的质粒和lipofectamine2000混匀，室温静置20mind)把质粒DNA与Lipofectamine2000的混合液加入293T细胞中，37℃5%CO2培养箱中培养5小时后，换成新鲜的含10%血清的完全培养基4)转染24小时后观察质粒上荧光标记基因的表达情况以判断转染效率，同时该过程用来平衡培养体系至室温下3.luciferase检测1)初次使用Dual-Glo™LuciferaseAssaykit时，需要将Dual-Glo®LuciferaseBuffer和Dual-Glo®Stop&Glo®Buffer提前数天放于室温下平衡；将Dual-Glo®LuciferaseBuffer完全加入到Dual-Glo®LuciferaseSubstrate瓶中，完全溶解底物，形成Dual-Glo®LuciferaseReagent，分装保存于-70℃2)24孔板中每孔去除250µl培养基，加入剩余体积同等量（即250µl）的Dual-Glo®LuciferaseReagent，室温反应10min以待细胞充分裂解，吹打混匀转移至1.5mLep管中3)根据需要的量配制Dual-Glo®Stop&Glo®Reagent待用（该试剂必须现配现用），如配制1.1mLDual-Glo®Stop&Glo®Reagent，即取11µlDual-Glo®Stop&Glo®4/4Substrate加入到1089µlDual-Glo®Stop&Glo®Buffer中4)吸取100µl步骤2)中的细胞裂解液100µl于Lockwellmaxisorp检测板中，酶标仪检测fireflyluminescence（萤火虫荧光酶荧光值），该步骤在细胞经Dual-Glo®LuciferaseReagent裂解反应10min-2hours之内完成5)检测fireflyluminescence后，再在每孔中加入50µlDual-Glo®Stop&Glo®Reagent，室温反应，在10min-2hours之内完成Renillaluminescence（海肾荧光酶荧光值）的检测，该检测时间点距Dual-Glo®Stop&Glo®Reagent加入时间点应与fireflyluminescence检测时间点距Dual-Glo®LuciferaseReagent加入时间点一致6)数据收集和分析（详见报告）