质谱定量的原则系列讲座

质谱定量的原则系列讲座（转自分析测试百科叮当空间）质谱定量的原则01--目录：1．质谱定量的简介a)总离子流b)选择离子监测（SIM）c)选择反应监测（SRM/MRM）2．开发一个SRM方法3．内标4．PK/LC/MS/MS药物代谢动力学的LC/MS/MS的反相液相色谱的方法开发5．样品制备6．标准和标准曲线的准备a)做标准曲线的步骤b)标准曲线的稀释方案Scheme的举例c)标准曲线的运行d)进行标准品和样品的随机化e)系统运行的实用性f)“QCs”质量控制7．相关的PK资源8．定量的技巧Tips质谱定量的原则02——质谱定量的简介和LC/MS监测的模式简介本教程主要用于：使用质谱作小分子药代动力学分析，即PK/MS。除此之外，这些同样的原则也可用于生物基质中肽和蛋白的定量。传统上，在使用现代质谱定量之前，定量是用HPLC高效液相色谱和UV紫外检测器实现的。HPLC药代动力学分析建立在保留时间、峰面积和紫外光谱性质的基础上的。HPLC方法的缺点是灵敏度不够、缺乏特异性。我们已经看到一些实例，一个化合物的确已经代谢了，然而保留时间和紫外光谱上，母离子和代谢物无法区分。这种缺少特异性的分析时不时会误导研究者。所以在药代动力学分析中，基于质谱的表征现在是一种新型的重要的工具。质谱定量中已经被广泛接受的方式是MS/MS定量。这种定量常通过三级四极杆或离子阱质谱实现。要求使用MS/MS的原因是：许多化合物有同样的质量。当使用第一个维度即单级质谱MS去定量时，也会缺乏特异性，尤其是对于像血液那样的复杂的基质。第二个维度的MS（即MS/MS）在大多数情况下，能够提供唯一的断裂。合并特异的母离子质量和唯一的碎片离子信息，可以选择性地监测被定量的化合物。下面我们将讨论获得和可视化LC/MS数据的方法。获得和可视化LC/MS的数据，或称为：质谱数据如何在一个LC/MS实验中表达？典型的方法，质谱被设置为扫描特定的质量范围。在全扫描分析中，质量扫描范围较宽；在选择离子监测SIM时，质量扫描范围较窄。依赖于扫描的类型，一个独立的质量扫描时间可以从10ms到5秒。在一次LC/MS分析中可获得许多个扫描。LC/MS数据的表示方法为：把每个质量扫描的离子流信息叠加，画出随时间变化的总离子流，横轴是时间，纵轴是强度。总离子流图非常像HPLC的紫外图，见图1。。下面我们将讨论各种扫描的模式，和这些模式同质谱定量的关系。最常见的LC/MS数据模式为：（1）总离子流图（2）选择离子监测（SIM）（3）选择反应监测（SRM）或多反应监测（MRM）：MRM和SRM本质上是同样的实验模式。全扫描分析图1从药代分析中得到的全质量范围的总离子流图（TIC）非常像HPLCUV图，除了：质谱能检测到更多的化合物，尤其是没有紫外吸收的化合物。总离子流是一个叠加图，叠加了每个质量扫描的离子流。当一个小分子或小肽流出HPLC色谱柱时，相对强度上升，在TIC图上出现了一个峰，横轴是时间。每个质量的化合物都被记录在TIC图上。找出感兴趣的化合物可能是困难的，因为许多化合物有相同的质量。化合物的天然质量不是鉴定的唯一性数据。设置一个确定的质量，可以画出一个提取离子流图，但这个图的强度会比下面介绍的SIM实验中的强度低。（注意：TIC指的是在一段时间内采集的质量扫描数据，不特指扫描范围或质谱实验的类型。例如，我们可以在SIM或SRM实验中获得TIC图。然而，为简单起见，我们将把这些图称为SIM和SRM图，而不是SIMTIC图。）SelectedIonMonitoring选择离子监测在选择离子监测中，质谱被设置为扫描一个非常小的质量范围，典型的是一个质量数的宽度。选择的质量宽度越窄，SIM的确定度越高。SIM图就是从非常窄的质量范围中得到的离子流图。只有被该质量范围选择的化合物才会被画在SIM图中。图1和图2是同一个样品的谱图，然而它们看起来很不相同。原因是在SIM图中，画的是TIC图中较少的组分。SIM图是比TIC图更确定的图。图2然而，SIM图仍显示了许多峰，不能唯一地确认我们感兴趣的化合物。一个复杂的样品（比如血清或血浆）中，这样的图是一个典型的SIM图。许多化合物有同样的质量，在ESI中还有多电荷峰也和我们感兴趣的化合物有同样的m/z值。SIM实验比全扫描实验更灵敏，因为质谱在一个更小的质量范围上驻留（dwell）更长的时间。SelectedReactionMonitoring选择反应监测（SRM）SRM被大多数科学家在质谱定量中使用，见图3。SRM中，可以监测一个特征的唯一的碎片离子，在很多非常复杂的基质中进行定量。SRM图非常简单，通常只包含一个峰。这种特征性使SRM图成为灵敏度高且特异性强的理想的定量工具。图3SRM的过程：选择一个特征的母离子做MS/MS，在其碎片中选择一个特征的子离子作为监测离子。可以把SRM理解为碎片离子的SIM。这种特征性的实验被成为“transition”（跃迁），可以表示为：母离子→子离子，举例：534→375质谱定量的原则03——建立一个SRMTransition534→375一个定量分析方法应该是特征性的、高准确度和高灵敏度的。在不牺牲上述特性的前提下，建立方法应该尽可能地快速，质谱定量可以很好地满足这些规则。在建立一个感兴趣的化合物的MS/MS碎片transition的时候，一种优化transition的方法是用注射泵进样（syringepump）该化合物来优化。先在全扫描方式中优化母离子信号。因为MS/MS的灵敏度将依赖于化合物在全扫描模式中是否响应得好，要尽可能地优化全扫描的、非CID响应的MS信号。然后优化碰撞能CE和碰撞气体，给出丰度最高的碎片离子。不能使用太大的碰撞能CE，因为太大的CE会丢失稳定的、有价值的碎片峰。“我应如何优化碎片峰？”可以用注射泵进样化合物，进行MS/MS，挑出一个稳定的碎片峰，当改变碰撞能和碰撞气体参数时监测它的离子流。最后当获得最大的碎片离子峰响应时确定碰撞能和碰撞气体参数。现代的三重四极杆质谱都可以自动优化。从优化好的MS/MS谱中，选择一个合适的碎片峰用于定量监测。如图A所示，母离子质量为534，似乎从图B中可以很容易选择一个碎片峰做Transition。一个基本考虑是尽可能不要选择离母离子太近的质量。非常常见的，是化合物的失水峰或失氨（ammonia）峰，例如：534－517＝17。我们应尽可能不要选择失水峰或失氨（ammonia）峰做SRM，因为这会导致一个不是很特异的transition。这里，Transition534→375是一个好的选择。另外要注意的是：要选择一个稳定的峰。当直接进样化合物时，被选择做Transition的峰必须每次扫描响应都一致。提示：当优化MS条件时，最好能模拟实际做样的条件。例如：实际做样时色谱流速是400ul/min，化合物在30%有机相时流出，用注射泵进样优化MS条件时最好模拟这个条件，即设置HPLC流速为400ul/min，30%有机相；然后用三通注入化合物。同时，第一次优化实验时，我们可以选择60/60的梯度，去表征化合物的疏水性，从而得知它在C18反相柱上的色谱行为。如果你对所有的化合物都按这样的方法实验，你就可以建立一个洗脱数据库，可以作为将来实验的参考。注：60/60梯度的意思是：梯度从近100%水相开始，在60分钟内到达60%有机相。质谱定量的原则04——内标在做MS定量时应该使用内标。选择一个合适的内标，将能减少因为样品提取、HPLC进样和离子化的多样性造成的差异。在复杂基质的分析中，在SRM积分图上，在标准曲线的低端，常会见到：两个不同的浓度水平，会给出近乎一致的响应。只有当使用一种内标时，这两个点才能被区分。一些研究者试图在实验中不用内标去做标准曲线，但成功率不高。我们在标准曲线上每个浓度水平都重复进样3次。没有内标的情况下，重现性％RSD常常会高于20%；而当使用内标时，%RSD能降低到近2%。我要如何选择一个内标?最好的内标是待定量的化合物的同位素内标。同位素标记的内标将和待测物有相似的回收率、ESI离子化响应，和相似的色谱保留时间。如果你运行的不是临床药代动力学定量，可能很难判断上述说法，因为特殊的合成一个同位素标记的内标，是非常昂贵和耗时的。通常，如果你和一个医学的化学家工作，他们会有一个化合物相似物库，可以被用作内标。这些类似物，在化合物合成中被测试，和该化合物性质相似可以被用户定量内标，而且更重要的是，这些类似物和该化合物的母离子质量有微小的差异。尽量不要使用去甲基化（－14）或者是氧化的（＋16）的类似物作内标，因为待测化合物的母离子常会发生同样的代谢。常见的做内标的类似物是氯代的化合物。氯代的化合物类似物会和待测化合物有相似的色谱保留时间，这是内标的一个重要特性。我们已经发现内标物的一个最重要的特性是它和待测化合物共流出。我该如何使用内标？首先，内标添加需在样品测试方法的开始阶段，典型的，应在血浆crash或固相萃取之前。内标应用同一浓度水平添加（包括标样）。内标应给出可靠的质谱响应。应该注意的是：内标的量应添加得合适，应高于定量限，但不能过高，因为过高的内标响应会抑制被分析物的离子化。“我应该添加多少量的内标？”这是一个重要的问题。通过做一些试分析：早、中、晚的时间点，也许一个或两个标准点，你应该知道你的样品中化合物的大概量。这些信息非常有价值，可以帮助建立一个合适的标准曲线，并知道应添加多少量的内标。举例来说：如果待定量的样品浓度范围是100fg～25pg，检测限是100fg，你应该添加5～10pg的内标。一个好的经验法则是：内标物的量大概是标准工作曲线浓度最高点的1/3。这将给出一个比较不错的响应，并且不会抑制和干扰待测样品的离子化。见图1图1内标的量（内标.gif）质谱定量的原则05——液相色谱串联质谱联用药代动力学方法开发更快就是更好！在每一个药代动力学分析中更快就是更好！样品组/系列包括：重复的标准品，QC质控样品，和样品，加起来大概要进行300次分析。如果每个样品实验耗时15分钟，整套分析要75个小时。高要求的实验（加上质谱）总计要超过3天时间。一些该领域的研究者可以只花1～2分钟分析一个样品；而大多数的PK/MS的实验室一般很容易做到花3～4分钟分析一个样品。如果对上面同样的300个样，4分钟一个实验的话，总分析时间可减少到20个小时。所以，每分钟都是很重要的！在2mm×30～50mm反相短柱上可以获得快速的梯度和快速的平衡时间。LC/MS的非药动实验中，流速一般为200µl/min.，而在LC/MS的药动实验中，流速一般设为400～1000µl/min。更快的流速有助于加速洗脱和平衡。下面是典型的LC/MS药动实验条件：LC/MS药动实验方法：色谱柱：2.1X50mm,5µm,100Å,C18柱温：40℃流动相：A为水相（0.1%甲酸），B为乙睛（0.1%甲酸）流速：400µl/min梯度：Time(min.)%B0252802.125425Notes：a)调节初始的％B使其适应该化合物b)试着减少梯度时间到1分钟以缩短方法时间优化梯度：当然你要对每个化合物特别的进行方法优化。我们推荐创建一个色谱数据库，详细地记录实验室接手的各个化合物的疏水性（可以运行60/60方法完成）。当你需要挑选一个相似疏水性的内标时，这样的色谱数据库将非常有用。在长时间的梯度中，％B的起始值一旦明确，那么在缩短时间时，就把％B的值降10%。举例来说，如果％B初始值是40%，那么在运行液质药动方法时，起始值%B就是30%。这种方法将确保你的化合物可以留在你的柱子上。优化柱子和流动相：在上面举例的液相条件中，一些化合物有可能响应得不好。一些化合物可能要求不同的有机改性试剂或有机相。一般，磷酸盐不适用于质谱。有些人用10～20mM低浓度的醋酸铵作A相缓冲盐。另一些人合并甲醇和乙睛在B相中。如果你的化合物峰形不好，需要改变几个或者所有的实验参数。必须选用合适的柱子去获得好的回收和好的峰形。帮助提示：1）一个质谱实验室可能要整日忙着