第四、五讲细菌典型生理生化鉴定技术

细菌典型生理生化鉴定技术郑培君第一节细菌的生化试验一、概述•（一）、什么是生化试验?•指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。（二）检验细菌的生化试验范围1、糖（醇）类代谢试验2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验4、呼吸酶类试验5、毒性酶类试验（三）生化试验的方法1.在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的pH值变化。2.在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。3.根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。4.根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。（四）生化试验的注意事项1、待检菌应是新鲜培养物。培养18~24h。2、待检菌应是纯种培养物。3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4、应做必要的对照试验。5、提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进行试验。二、糖醇类代谢试验（一）糖醇类发酵试验（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验（三）V-P试验（四）甲基红（MethylRed）试验MR（五）七叶苷水解试验（六）甘油品红试验（一）糖醇类发酵试验原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，有的只能分解1~2种糖醇，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。1、常用的糖醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇2、试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃培养1~3天，每天观察结果。3、结果观察和记录记录：•产酸不产气，阳性，以“+”表示•产酸产气，阳性，以“⊕”表示•不产酸产气，阴性，以“-”表示气泡导管气泡气泡阳性阳性阴性（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验1、原理：细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。2、方法•取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37℃培养2~4h天，每天观察结果。3、结果观察与记录封油管未封油管发酵型产酸（黄色）产酸（黄色）氧化型不产酸（绿色）产酸（黄色）产碱型不产酸（绿色）不产酸（绿色）（三）V-P试验1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。2、试验方法（1）奥梅拉（O’Meara）法（2）贝立脱（Barritt）氏法（3）快速法（１）奥梅拉法：将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃培养48h，每1mL培养液加奥梅拉O’Meara试剂0.1mL，摇动试管1~2min，静置于37℃恒温箱4h，或在48~50℃水浴放置2h后判定结果。（2）贝立脱法：将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃培养2天，每2mL培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1mL，再加40%氢氧化钾水溶液0.4mL，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1℃培养4h，如显现红色为阳性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。（3）快速法：将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。3、结果观察与记录（1）发酵管出现红色者，为阳性，记V-P+（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记V-P-（四）甲基红试验（MR）1、原理细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基pH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。2、试验方法挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃或30℃（以30℃较好）培养3~5天，从第48h起，每日取培养液1mL，加入甲基红指示剂1~2滴，立即观察结果。MR-VP试验原理及照片V-P3、结果观察与记录（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR+；（2）呈橘黄色或黄色为阴性，记MR-，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。MR+MR-（五）七叶苷水解试验１、原理：七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与Fe2+结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。2、试验方法将待试纯培养物少许，接种于七叶苷培养基，于36±1℃培养24h,观察结果。3、结果观察与记录（1）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳性，记录为+（2）培养基不变色者，为阴性，记录为-（六）甘油品红试验1、原理：某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。2、试验方法取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，于36±1℃培养8天,并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。3、结果观察与记录（1）出现紫色或紫红色者,为阳性，记录为+；（2）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为-（六）甘油品红试验1、原理：某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。2、试验方法：取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，于36±1℃培养8天,并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。3、结果观察与记录（1）出现紫色或紫红色者,为阳性，记录为+；（2）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为-（一）靛基质（吲哚）试验（二）H2S试验（三）尿素酶试验（四）氨基酸脱羧酶试验（五）苯丙氨酸脱氨酶试验（六）明胶（Gelatin）液化试验三、氨基酸和蛋白质代谢试验（一）靛基质试验1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。2、试验方法：所用试剂:（1）柯凡克(Kovacs)试剂;（2）欧—波试剂将待检菌小量接种于培养基中，于36±1℃培养24~48h时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5mL覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。靛基质试验原理及照片靛基质+3、结果观察与记录呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+无红色者，为阴性反应，记-（二）硫化氢（H2S）试验1、原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌。2、试验方法：挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养上，于36±1℃培养24~48h，观察结果。3、结果观察与记录•培养基底部呈黑色，为阳性，记+•培养基底部无黑色，为阴性，记-（三）尿素酶试验1、原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。2、试验方法：挑取大量培养18~24h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。尿素酶试验图阳性3、结果观察与记录•培养基变呈粉红色，为阳性，记+•培养基颜色不变，为阴性，记-（四）氨基酸脱羧酶试验1、原理：某些细菌能产生氨基酸脱羧酶,可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用,生成胺类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性,如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。2、试验方法取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在36±1℃培养1~4天，每天观察结果。3、结果观察与记录•试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记+•试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记-试验管对照管阳性+阴性-对照管变黄试验管变黄阳性反应试验管颜色变化过程紫色→黄色→紫色原理：对照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养的早期（10~12h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液pH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，pH又回升至碱性，指示剂显紫色。阳性反应试验管颜色变化过程：紫色→黄色→紫色（五）苯丙氨酸脱氨酶试验1、原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。2、试验方法•从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在36±1℃培养18~24h后，加入氯化铁溶液4~5滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。3、结果观察与记录•试验管立即出现绿色，为阳性，记+•无色为阴性，记-。加氯化铁试剂出现绿色+（六）明胶液化试验1、原理有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。2、试验方法挑取培养18~24h的待试菌，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。另取一支未接种的培养基一同培养作对照，每天取出两支试管，放入冰箱放置20~30min后，再观察结果。3、结果观察与记录•明胶液化，为阳性，+。•明胶凝固，为阴性，-。四、有机酸盐和铵盐的利用试验柠檬酸盐利用试验丙二酸盐利用试验（一）枸橼酸盐利用试验1、原理：某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。2、试验方法挑取待检菌，在西蒙柠檬酸盐培养基斜面上密集划线接种，在36±1℃培养1~4天，每天观察结果。3、结果观察与记录•斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+；•无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-柠檬酸盐试验原理及斜面照片阳性+（二）丙二酸盐利用试验1.原理:某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠,使培养基变为碱性,培养基由草绿色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。2、试验方法取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二酸钠培养基上，于36±1℃培养48h，观察结果。3、结果观察与记录•培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+;•培养基无颜色变化,为阴性,记-五、呼吸酶类试验氧化酶试验过氧化氢酶试验硝酸盐还原试验氰化钾试验（一）氧化酶试验1.原理:氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和α-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。试剂•1%α-萘酚-乙醇液•1%盐酸二甲基对苯二胺2、试验方法•用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂1~2滴在培养物上,再加入1%α-萘酚-乙醇液1~2滴,在30秒内判定试验结果。3、结果观察与记录•在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记+•不变色或为红色者,为阴性,记-成蓝色为+不变色或为红色为-（二）过氧化氢酶试验原理：某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。2、试验方法•挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。3、结果