第五章亲和层析分离技术.

第五章亲和层析技术北京化工大学谭天伟教授亲和层析技术5.1简介5.2亲和层析理论5.3亲和层析介质活化5.4常见底亲和层析技术利用生物大分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和层析分离技术5.1简介简介——亲和配基单专一性的小分子配基基团专一性小分子亲和配基专一性的大分子亲和配基免疫亲和配基基因专一性的大分子亲和配基参数生物专一性（AC）拟生物专一性配基亲和层析IMACDLACHLAC专一性很高较高中等较高，取决于吸附条件配基交联技术很多环氧化物直接吸附或对氧化物解吸难易中等容易化学交联容易容易吸附容量低，0.1-1.0%配基利用高高中等再生及稳定性较差，易变性高高高，可用浓或处理成本高较低最低较低不同亲和层析分离方法的比较简介——亲和洗脱亲和洗脱是和亲和吸附（AffinityAdsorption）对应的，即利用在洗脱液中加入和吸附目标蛋白有专一性的物质，而只将目标分子解吸下来。亲和洗脱可用于亲和层吸，也可以用于普通的层析如离子交换等的解吸。亲和洗脱一般采用和目标分子具有识别性的小分子或类似物。亲和层析分离技术亲和层析的理论亲和介质的制备常见的亲和层析LMELMEElmKKd1EEKd1LMELMEKlm15.2亲和层析的理论当蛋白质在非凝胶相和凝胶相之间达到平衡亲和层析的理论对正常的凝胶过滤色谱而言idEVKVV0亲和色谱中，固定配基在蛋白和凝胶之间产生的额外亲和作用idEVKVV'0'亲和层析的理论EELMEKd1'lmEEEKLMVVVV0'lmEEKLMVV1'实际上，Ve’/Ve很难测定，但在洗脱液中，加入可活性配基或竞争性抑制剂，使固定配基的表边的亲和力降低，其数值可以测得LMELMEElmdKK11EIIEK11111IEIEik亲和层析的理论推导得到IkKKLMVVVVVilmEEEE10'1在可溶性亲和竞争性配基的存在下，固定配基对酶的阻滞作用降低，其程度取决于可溶性配基和固定配基的相对浓度和解离常数。亲和层析的理论5.3亲和介质的制备介质的选择介质的活化和偶联亲和配基固定偶联的密度的测定间臂分子的选择介质的选择通常而言，亲和色谱的介质应具备下面四个条件：√具有多孔网络结构√非特异吸附小，基质化学性质应是惰性，表面电荷尽可能低；√理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸附条件的变化而发生变化；√基质必须能够活化或功能化介质是亲和配基附着的基础，起着支撑和骨架作用介质的选择多糖类：纤维素（cellulose）、葡聚糖（dextrin）琼脂糖（agarose）聚丙烯酰胺无机基质可控制孔径多孔玻璃（CPG）、陶瓷和硅胶介质的选择用于分析时，专一性比容量及稳定性重要，而应用制备时，吸附剂的稳定性是最主要的指标，同时还要考虑成本因素。对于不同的介质而言，这些要求不可能同时满足。所以在介质的选取时，应该根据具体的分离要求选择合适的介质。专一性（Specifcity）、容量（capacity）及稳定性（stability）是衡量所选介质好坏的三个标准介质的活化和偶联介质的活化和偶联多糖基质溴化氰法，三嗪法高碘酸盐法环氧化物法苯醌法其他活化剂聚丙烯酰胺基质戊二醛法肼法多孔玻璃与硅胶溴化氰法多糖基质三嗪法多糖基质高碘酸盐法多糖基质环氧化物法多糖基质苯醌法多糖基质其他方法——甲苯磺酰氯多糖基质戊二醛法聚丙烯酰胺基质聚丙烯酰胺基质肼法多孔玻璃与硅胶亲和配基固定偶联的密度的测定分光光度法重量差法分析水解作用分析元素分析法间臂分子的选择由于生物大分子的空间结构及层析介质本身孔结构的因素，往往在配基和基质骨架之间引入一个间臂分子，可显著地提高配基的空间利用度，即提高吸附容量。间臂分子的引入时要考虑两个因素：空间位阻，疏水作用5.4常见的亲和层析核苷酸及辅酶和层析固定化金属离子亲和层析染料亲和层析免疫亲和层析基团专一性大分子亲和层析共价色谱常见的核苷酸及辅酶亲和层析介质配基分类配基生产公司典型应用腺苷腺苷3’，5’－环化单磷酸（CAMP）PLBiochemicalSIGMA腺苷激酶及脱氨酸腺苷－3’，5’二磷酸（3’，5’－ADP）PLBiochemicalSIGMAPharmcia依赖辅酶A的酶腺苷－5’－单磷酸（AMP）PLBiochemical磷酸化酶腺苷－5’－三磷酸（AIP）PLBiochemical激酶辅酶辅酶A（CoA）PLBiochemicalCoA转移酶，乙酸-CoA酶氧化型辅酶I（NAD＋）PLBiochemicalSIGMA5-核苷酸酶氧化型辅酶Ⅱ（NADP＋）PLBiochemical核酸酶核苷酸鸟苷-5’-三磷酸SIGMA谷氨酸脱氢酶5.4.1核苷酸及辅酶亲和层析N6（6-氨己基）氨甲酰-AMP-Sepharose间接偶联法示意图核苷酸及辅酶亲和层析核苷酸及辅酶亲和层析核苷酸亲和层析的合成碳二亚胺直接法偶联间接偶联法核苷酸亲和层析的吸附和解吸5.4.2固定化金属离子亲和层析螯和基团和金属离子的选择亲和层析介质的合成固定化金属离子亲和层析的吸附和解吸条件5.4.3染料亲和层析染料亲和层析介质的制备蛋白质的吸附和解吸染料亲和层析SO3HNNNClNHSO3HNHNH2SO3HNHOOCibacronBlueF3G-A结构图HNRSO3HHO3SNNNClNHNNNClHNNHSO3HROH3SHOOHNNSO3H其中R为:染料亲和层析ProcionRedH-E3B结构图染料配基和蛋白质作用大小排列第一组第二组第三组第四组第五组ProcionBlueMX-7RXCibacronBlue2-RAProcionYellowMX-6GRemazolOrgane3RCibacronBrown3-GRAProcionRedMX-4RProcionYellowMX-4RRemazolOrganeRCibacronBlueF3-GAProcionRedH-E3GRemazolBlueRProcionYellowH-E6RProcionBlueMXGProcionOrgangeMX-2RProcionRedMX-7BProcionblueH-ERDProcionGreenH-E4BDProcionRedH-3B染料亲和层析5.4.4免疫亲和层析免疫亲和层析介质的制备免疫亲和层析的吸附和解吸比较项目单抗多抗设备需求多简单手工时间多少抗体数量大中等提供的持久性长期短抗体质量高低亲和专一性可高可低多数专一性高免疫亲和层析单抗和多抗的比较5.4.5基团专一性大分子亲和层析ProteinA亲和层析IgG抗体解吸：1Macetatebuffer0.1MglyceicineHClbufferConA亲和层析糖蛋白：免疫球蛋白，IgM低密度酯蛋白肝素亲和层析原理（a）吸附过程；（b）洗脱过程；（c）再生过程5.4.6共价色谱引入硫醇基引入双硫键共价介质的合成共价色谱的吸附和解吸1、上样预处理2、吸附吸附时间较长，柱子长度检测3、解吸10－25mMDTT（二硫苏糖醇），25－50mM2－巯基乙醇，半胱氨酸层析操作应用举例①从JackBean中分离尿素酶Urease②木瓜蛋白酶的分离纯化③POI和GIT（proteindisulphideisomerose）和（glutathioseinsulmtramchydrogerac）的分离