第五章固相析出分离法.

第五章固相析出分离法•通过改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。•盐析法•有机溶剂沉淀法•等电点沉淀法•结晶法第一节盐析法(saltprecipitation)•定义：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。•优点：简单、经济、较少变性•缺点：分辨率不高，要除盐两种现象：•盐溶：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大•盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小一、基本原理原理•形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。•中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了水化膜，使其沉淀。在盐析区，符合公式logS=β-KsμS——蛋白质溶解度，g/L；μ—盐离子强度,Ci——i离子浓度，mol/L；Zi——i离子化合价；β——常数,为纵坐标上的截距;Ks——盐析常数。β、KS•β为纵坐标上的截距，是外推截距，与无机盐种类无关。•KS是盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关，但与温度和pH无关。•两种类型：（1）在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作KS盐析法。（2）在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作β盐析法。二、影响盐析的因素（一）、无机盐的种类盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子更为明显。PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I―NH4+＞K+＞Na+＞Li+盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵(二）溶质（蛋白质等）种类的影响盐析分布曲线（三）蛋白质浓度的影响•蛋白质浓度提高，盐用量减少（四）温度的影响•温度的变化会影响β值。•在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，但在高盐溶液中常相反。（五）pH的影响•当溶液的pH在蛋白质等电点附近时，β值最小。•利用β值最低点时pH的不同，可以分级沉淀蛋白质.三、盐析操作（一）盐析用盐的浓度表示固体粉末硫酸铵饱和溶液常用“饱和度”来表征硫酸铵在溶液中的最终浓度，25℃时(NH4)2SO4的饱和浓度为4.1mol／L，定义它为100%饱和度.（二）盐析方法和注意事项1、分部盐析法2、重复盐析法3、反抽提法一定的盐浓度下将目的蛋白夹带一定量的杂蛋白一同沉淀。将沉淀用较低浓度盐溶液平衡，溶出其中的杂蛋白。分部盐析法反抽提法(RNA聚合酶)注意事项•“局部过浓”•温度（室温）•分离方法第二节有机溶剂沉淀(OrganicSolventPrecipitation)•定义：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。一、基本原理•1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。•2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。一些溶剂的介电常数•优点：乙醇等有机溶剂易除去，产品更纯净；密度差较大，离心收集。•缺点：容易使蛋白质变性，操作常需低温，成本高，需防火防爆二、影响沉淀效果的因素（一）有机溶剂种类及用量常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。（二）pH的影响许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低，溶液pH应在等电点附近，还须考虑蛋白质的稳定性。（三）温度（低温沉淀）有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著地减小。（四）无机盐的含量低盐：有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变性。高盐：增大蛋白质在有机溶剂―水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夹带盐。（五）某些金属离子的助沉淀作用多价阳离子，如Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度降低。胰岛素精制：（六）样品浓度浓度小时，增加溶剂投入量和损耗。浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。蛋白质浓度0.5%～2%；粘多糖浓度1%～2%。第三节其它沉淀方法一、等电点沉淀法对于两性物质，等电点时净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，发生沉淀。杂蛋白胰岛素纯化：胰岛素•pH8•除去碱性杂蛋白•pH3•除去酸性杂蛋白二、成盐沉淀法金属离子沉淀：与生物分子的酸性功能团作用的金属复合盐法；有机酸类复合盐沉淀:与生物分子的碱性功能团作用的有机酸复合盐法（如苦味酸盐、苦酮酸盐、丹宁酸盐等）。1．金属离子沉淀：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等；2．生成有机酸类复合盐沉淀（1）丹宁即鞣酸（2）雷凡诺（3）三氯乙酸（TCA）三、亲和沉淀利用亲和反应原理，将配基与可溶性的载体偶联后形成载体-配基复合物（亲和沉淀剂），该复合物可选择性地与蛋白质结合，在一定条件下沉淀出来。中性可溶，酸性沉淀。四、高分子聚合物沉淀水溶性非离子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。五、表面活性剂十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB）十六烷基氯化吡啶（CPC）酸性多糖六、选择性变性沉淀法•热变性沉淀法•酸碱变性沉淀法•利用试剂（氯仿）固相析出分离法•第一节盐析法•第二节有机溶剂沉淀•第三节其它沉淀方法一、等电点沉淀法二、成盐沉淀法第四节结晶(crystallization)•定义：溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体。•通过结晶，溶液中的大部分杂质会留在母液中，经过滤、洗涤可得到纯度高的晶体。一、结晶过程指溶质自动从过饱和溶液中析出形成新相的过程。C2—小晶体的溶解度；C1—普通晶体的溶解度；ρ—晶体密度；M—晶体质量；σ—晶体与溶液间的界面张力；γ2—小晶体的半径；γ1—普通晶体的半径；结晶包括三个过程：(1)形成过饱和溶液;(2)晶核形成;(3)晶体生长。浓度温度图二、过饱和溶液的形成(结晶方法)（一）、蒸发法（二）、温度诱导法热盒技术（三）、盐析结晶法（四）、透析结晶法（五）、有机溶剂结晶法温度诱导法盐析结晶法透析结晶法（六）、等电点法（七）、微量扩散法（八）、化学反应结晶法调节溶液的pH或向溶液中加入反应剂，成新物质，结晶析出。（九）、共沸蒸馏结晶等电点法化学反应结晶法综合利用三、提高晶体质量的途径工业上通常希望得到粗大而均匀的晶体，便于过滤与洗涤。（一）、晶体大小影响晶体大小的主要因素有过饱和度、温度、搅拌速度、晶种等。晶种（二）、晶体形状改变晶体外形，可用:选择不同的溶剂、控制过饱和度、结晶温度、调节溶液的pH和有目的地加入某种能改变晶形的杂质等。（三）、晶体纯度晶体表面具有一定的物理吸附能力。重结晶：即将晶体用合适的溶剂溶解再次结晶。重结晶(recrystallization)•溶解度受温度影响较大的物质，将产品溶解在热的溶剂中，缓慢降低温度析出晶体。•将溶质溶于一种溶剂中，然后将第二种溶剂加热后缓缓地加入，放置一段时间使结晶完全。红霉素重结晶用于生物物质重结晶的溶剂一般有蒸馏水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低级醇等。第五章•1、盐析沉淀是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而达到纯化目的的方法。•基本原理：一、盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，因此盐离子部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互结合。•二、中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，疏水区相互作用，使其沉淀。2、影响盐析效果的因素：（1）无机盐的种类（2）溶质（蛋白质）种类的影响（3）蛋白质浓度的影响（4）温度的影响（5）pH的影响3、影响沉淀效果的因素：（1）有机溶剂种类及用量（2）pH的影响（3）温度（4）无机盐的含量（5）某些金属离子的助沉淀作用（6）样品浓度4、形成过饱和溶液的方法：（1）蒸发法（2）温度诱导法（3）盐析结晶法（4）透析结晶法（5）有机溶剂结晶法（6）等电点法（7）微量扩散法（8）化学反应结晶法（9）共沸蒸馏结晶5、影响晶体大小的因素：（1）过饱和度：增加过饱和度能使成核速度和晶体生长速度加快，对前者影响较大，过饱和度增加，晶体较细小。（2）温度快速冷却，达到较高的过饱和度，晶体细小形成针状晶；反之，缓慢冷却得到较粗大的晶体。（3）搅拌速度：搅拌能促进成核和加快扩散，提高晶核长大的速度，过快则晶体会被打碎。经验表明，搅拌速度愈快，晶体愈细。（4）晶种加入晶种能诱导结晶，还能控制晶体的形状、大小和均匀度。6、等电点沉淀的特点，如何应用对于两性物质，等电点时净电荷为零，使稳定的双电层及水化膜变弱或破坏，分子间排斥电位降低，吸引力增大，相互聚集，产生沉淀。等电点沉淀法操作简便，试剂消耗少，给体系引入的外来物质少，常用的纯化方法，主要适用于水化程度不大，在等电点时溶解度很低的物质。应用：胰岛素纯化时，在pH8。0除去碱性杂蛋白，调pH3。0除去酸性杂蛋白，粗提液经此处理后纯度大大提高，有利于后步提取操作。7术语Ks盐析：在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析。β盐析：在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析。盐析分布曲线：蛋白质沉淀的速度可用—dS/dP对盐饱和度（P）作图表示。蛋白质沉淀的速率开始时十分迅速，以后变慢，从起始沉淀到沉淀结束，形成具有尖峰的曲线。透析结晶法：为了使蛋白质溶解度的变化缓慢而且连续，而进行透析的方法；在盐浓度缓慢降低的结晶情况下，进行透析。