第五章沉淀分离

生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性第五章沉淀分离5.1概述5.2盐析法5.3有机溶剂沉淀法5.4非离子多聚物沉淀法5.5其他沉淀法5.1概述•沉淀的概念沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相的过程。在生物工业、有机化工工业、无机化工工业及实验室分析中，沉淀都是分离与纯化中最常用的方法之一。沉淀：溶质→固相5.1概述•沉淀的作用有二：一是浓缩，通过沉淀目的产物由液相变成固相，浓缩倍数可达几十倍至数百倍；二是纯化，通过沉淀固液分相后，除去留在液相（如果目的产物是固相）或沉积在固相中（目的产物留在液相）的杂质。沉淀法操作步骤：①首先加入沉淀剂；②沉淀剂的陈化，促进粒子生长；③离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。5.1概述•沉淀分离的应用沉淀分离具有成本低、收率高、浓缩倍数大和操作简单等优点，因而广泛应用于氨基酸、酶制剂、抗菌素等生物工业中。对于某些不需纯度要求的生物产品（如工业用酶制剂），沉淀分离是一种常用提取方法。但对于某些纯度要求很高的生物产品，在沉淀分离中，浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀分离通常作为初步分离的一种方法。5.1概述•沉淀剂的选择沉淀剂的作用是降低溶质的溶解度使之析出，除考虑沉淀效果外还需考虑下列因素：（1）沉淀剂对目的产物的结构与活性是否有破坏作用；（2）沉淀剂是否容易除去（离子交换、蒸发、萃取等）；（3）沉淀剂是否有毒性。5.1概述•沉淀的分类：沉淀法有许多种，根据所用沉淀剂的不同，生物工业中常用的沉淀方法有如下几种：①盐析法：多用于蛋白质和酶的分离纯化。②有机溶剂法：多用于生物小分子、多糖及核酸类产品的分离与纯化，有时也用于蛋白质和酶的沉淀。③等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。5.1概述④非离子型聚合物沉淀法：用于生物大分子，是发展很快的一种方法。⑤生成盐类复合物沉淀法：用于多种化合物（其中主要是酸性或碱性化合物），其中小分子物质的沉淀应用较多。⑥选择变性沉淀法：热变性或酸碱变性沉淀法，常用于除去某些不耐热及在一定pH值下易变性的杂蛋白。但应以在实验条件下所分离物质的活性不受影响为前提。5.2盐析法一般说来，所有固性溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程称为盐析。盐析法具有如下特点：（1）成本低，不需要什么特别昂贵的设备；（2）操作简单、安全；（3）对许多生物活性物质具有稳定作用；（4）存在产品与杂质的共沉作用，因而它只能作为初步纯化。5.2.1基本原理5.2.1.1盐析原理•蛋白分子的表面同时含有带电荷的亲水基团和不带电荷的疏水基团。•蛋白质的溶解度差别——取决于蛋白质分子中极性基团与非极性基团的比例和这些基团的排列位置。5.2.1.1盐析原理（1）水合作用：•在水溶液中，蛋白质分子中的亲水基团吸聚着许多水分子，这种作用称为水合作用。这些水分子在蛋白质分子的表面形成一层水化膜。•由于水膜的存在，各蛋白质分子间彼此隔开，使蛋白质分子在水中呈溶解状态。稳定的亲水溶液分子间彼此隔开形成水化膜水分子亲水基团水合作用5.2.1.1盐析原理（2）盐溶作用(Salt-in)：•蛋白质在低盐浓度下发生盐溶，这是因为当向蛋白质溶液中加入少量中性盐时，中性盐离子对蛋白质分子表面亲水基团（及水活度）的影响，增强了蛋白质分子与水分子的相互作用力，从而使蛋白质的溶解度增大。蛋白质溶液少量中性盐增加蛋白质分子与水分子的相互作用→蛋白质溶解度↑5.2.1.1盐析原理•蛋白质在高盐浓度下发生盐析，这是因为当中性盐浓度增加至一定程度时，蛋白质表面电荷被大量中和（亲水基团被大量中性盐离子所包围），水分子离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏水区域间的相互作用，使蛋白质分子相互聚集而沉淀。（3）盐析作用（Salting-out)：加入大量中性盐↓蛋白质溶液→亲水基团被中性盐包围→疏水基团的相互作用→蛋白质相互聚集（溶解度下降）暴露疏水区域水分子离开蛋白质lgS（溶解度）I（离子强度）盐溶盐析β图5-1溶液离子强度与蛋白质浓度的关系5.2.1.2Cohn方程式•蛋白质盐析时，蛋白质的溶解度与盐浓度的关系可由Cohn经验公式来表示：（5-1）其中：（5-2）式中：S—蛋白质的溶解度（g/L）I—离子强度mi—i离子的摩尔浓度（mol/L）Zi—i离子所带的电荷数（即离子的价数）β—盐析常数，与盐的种类无关KS—盐析常数，与温度和pH无关IKSslg221iiZmI•关于β值：（1）β值与盐的种类无关，在式（5-1）中，令I=0，则：β=lgS0（5-3）S0表示在纯溶剂中（即I=0）蛋白质的溶解度，由此可见β是一个与盐的种类无关的常数。β值的大小主要决定于蛋白质的性质。（2）β值不可能直接测定β值是假定离子强度I=0时，用外推法求出的。事实上由于盐溶作用的存在，I=0时的溶解度比低盐溶液要低。（3）β值随温度和pH而变•关于KS——主要取决于蛋白质和盐的种类，而与温度和pH无关。（1）KS与蛋白质种类的关系•对于不同的蛋白质，KS值的变化不是很大，大多不超过1倍。一般地：组成相同的蛋白质，分子量越大，KS较大，沉淀所需用盐量越少；蛋白质分子不对称性越大，KS值较大，越容易沉淀。•如表5-2所示为采用硫酸铵盐析时不同蛋白质的盐析常数。表5-2硫酸铵对不同蛋白质的盐析常数蛋白质马血红蛋白马肌红蛋白卵青蛋白纤维蛋白原KS0.710.941.221.46（2）KS与盐种类的关系•不同种类的盐，对KS的影响较大。KS值较大，就意味着该盐的盐析效果好，其中阴离子的影响较显著，而阳离子的影响是第二位的。•对于阴离子，含高价阴离子的盐，效果比低价的好。常用阴离子的盐析效果排列如下：柠檬酸盐＞PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-•对于阳离子，一般地高价阳离子（如Mg2+、Ca2+）不如低价阳离子，常用一价阳离子的盐析效果排列如下：NH4+＞K+＞Na+•而常用盐析剂盐析效果的排列顺序为：NaH2PO4＞(NH4)2SO4＞Na2SO4＞MgSO4＞NaCl表5-1不同盐类对碳氧血红蛋白的KS值和β值用不同盐类采用外推法求β值时，因温度和pH等条件不同，β值会有所变动。如表5-1所示，各种盐类对碳氧血红蛋白的β值在3.0左右。盐种类磷酸钾硫酸钠硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁β3.012.533.092.603.23KS1.000.760.710.690.335.2.1.3分段盐析法（1）KS分段盐析法——改变离子强度•对于蛋白质混合物，不同蛋白质在不同离子强度下的溶解度不同，发生盐析时所需的离子强度也就不同。根据这一原理，采用不同离子强度分步盐析的方法，即可从蛋白质混合物中分离各种不同的组份。如：硫酸铵饱和度开始析出的蛋白质种类20%纤维蛋白原28~33%血红蛋白33~35%拟球蛋白50%清蛋白80%肌红蛋白•这种改变离子强度的分段盐析法称为KS分段盐析法，常用于粗蛋白质和酶的分段分离。204060800100总蛋白目标蛋白质最适饱和度是30%，55%5.2.1.3分段盐析法（2）β分段盐析法——改变pH和温度•不同蛋白质在不同温度和pH值下的溶解度不同，因此在一定离子强度下改变混合液pH和温度亦可实现分段盐析的目的。•由于这种方法是通过改β值的大小来实现的，因而叫做β分段盐析法。此法常用于蛋白质的进一步纯化和结晶时使用。5.2.2影响盐析的若干因素5.2.2.1蛋白质的浓度与盐析的关系•从Cohn式可知，当蛋白质浓度较低时，发生盐析时需要较高的离子浓度。•如用硫酸铵盐析碳氧肌红蛋白（COMb）时：蛋白质起始浓度COMb开始沉淀时硫酸铵的饱和度90%的COMb沉淀析出时硫酸铵的饱和度30g/L58%65%3g/L66%73%由此可见，在不同浓度的蛋白质溶液中进行盐析，使用硫酸铵的饱和度是不相同的。5.2.2.1蛋白质的浓度与盐析的关系③用于分步分离提纯时，一般采用较稀的蛋白质溶液，多加一些中性盐，使共沉作用减少至最低限度，一般采用的蛋白质浓度为2.5~3.0%。不利于杂质分离易发生杂蛋白共沉作用盐用量利于杂质分离杂蛋白共沉作用少盐用量①蛋白质起始浓度高②蛋白质起始浓度低5.2.2.2pH对盐析的影响•蛋白质净电荷越多→它的溶解度越大→β值(lgS0)就越高。•改变溶液的pH→即可改变蛋白质分子所带净电荷的数量→从而改变β值的大小。•当pH值为蛋白质的等电点（pI）时，蛋白质分子上的净电荷数为零，溶解度最小，β值最低。因此在盐析时常选择溶液pH在该蛋白质的等电点附近。pH两种蛋白质的相对溶解度会随pH而变化很大；β随pH变化（1）对数关系（2）等电点附近有极小值34675７３４５６以磷酸盐沉淀COHb和以硫酸铵沉淀OA时，β随pH的变化８8OAβCOHbOA-卵清蛋白COHb-碳氧血红蛋白β5.2.2.2pH对盐析的影响（1）pH值对盐析的影响较大：•由于β=lgS0，当β值增加1时，溶解度（S）就增加10倍。•对某些蛋白质，在一定盐浓度下，不同的pH下的β值相差达3倍以上，也即蛋白质溶解度的变化达1000倍以上。•因此，盐析过程中pH的控制是非常严格的。（2）关于pI值：•在水中或稀盐溶液中测得的蛋白质等电点（pI），与高盐浓度下所测的结果不一定相同。•因此需根据实际情况调整pH值至蛋白质溶解度最低处，才能获得更好的效果。5.2.2.3温度对盐析的影响一般说来，温度升高，溶质的溶解度增大。（1）在低盐溶液或纯水中，生物大分子的溶解度大多数在一定范围内随温度的升高而增加；（2）在高盐溶液中，生物大分子的溶解度随温度的升高而减少，这是因为较高的温度会使蛋白质分子失水，因而利于沉淀。（3）尽管较高的温度有利于盐析沉淀，但较高温度易使蛋白质变性和发生共沉作用，因此蛋白质盐析过程通常在室温下进行（25℃左右），对某些温度比较敏感的酶，则需要在低温下（0~4℃）操作。5.2.3硫酸铵盐析法•常用盐析剂：硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、氯化钾、醋酸钠和硫氰化钾等。•硫酸铵：溶解度大，但缓冲能力弱，此外因含有NH4+，对蛋白质的分析会带来一定影响。•硫酸钠：不含氮，不影响蛋白质的定量测定；但溶解度较低，一般要在30℃以上操作效果较好。5.2.3硫酸铵盐析法表5-3不同温度下硫酸铵和硫酸钠的溶解度温度（℃）010202530硫酸铵(g/kg水)706.96730.73757.16769.05780.95(mol/kg水)5.355.535.735.825.91硫酸钠（g/L）13.818.424.828.232.6(mol/L)0.0970.1300.1750.1990.230硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。5.2.3.1硫酸铵的预处理•重金属离子的处理（医用）：（1）重结晶；（2）H2S处理—除重金属（对巯基敏感）•pH调整：（1）当蛋白质的pI5.0时，用硫酸或