茉莉酸甲酯对丹参茎叶丹酚酸和丹酚酸B含量的影响

1茉莉酸甲酯对丹参茎叶丹酚酸和丹酚酸B含量的影响李明冯世阳广东药学院中药学院广州510006摘要：目的探讨茉莉酸甲酯(methyjasmonat,MJ)对栽培丹参的药效成分影响，并为丹参地上部分的开发利用提供一定的研究依据。方法采用比色法和HPLC法，以丹酚酸和丹酚酸B为检测指标，对茉莉酸甲酯处理的丹参茎叶样品进行检测。结果丹参种苗经茉莉酸甲酯喷施处理后的48h内，其茎叶中丹酚酸和丹酚酸B含量均高于对照，在所测试范围5×10-9﹏5×10-3的浓度中，随浓度的升高而含量增加。结论外施茉莉酸甲酯能促进丹参茎叶中的丹酚酸和丹酚酸B含量的积累，可以考虑在生产中加以应用，并注意今后在丹参的种植及采收中地上部分的利用。关键词：丹参；茉莉酸甲酯；丹酚酸；丹酚酸BStudyontheeffectoftotalphenolicacidsandsalvianolicacidBcontentintheleavesandstemsofSalviamiltiorrhizatreatedbymethyjasmonatLiMingFENGShi-YangSchoolofChineseMateriaMedica,GuangdongParmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,ChinaObjective:ObjectiveTotheeffectofmethyljasmonate（MJ）onmedicinecompositionofcultivarSalviamiltiorrhiza，andprovidesomereferencefortheexploitationandutilizationoftheleavesandstemsinSalviamiltiorrhiza.MethodsTheleavesandstemsofSalviamiltiorrhizaweretreatedwithMJ,thecontentsofsalvianolicacidandsalvianolicacidBwereassayedbythemethodsofmetcolorimetryandHPLC.ResultsWithintheconcentrationof5×10-9﹏5×10-3,thecontentsofthesalvianolicacidandsalvianolicacidBinSalviamiltiorrhizatreatedbyMJwerehigherthanthecontrols,andshowedtherisedchangebytheincreasedconcentrationofMJ.Conclusion:ThecontentsofthesalvianolicacidandsalvianolicacidBintheleavesandstemsofSalviamiltiorrhizacouldwerepromotedbyMJ,andutilizsedincultivatedplantingofSalviamiltiorrhizashouldwasconsided.Keywords：SalviamiltiorrhizaBge；methyljasmonate；salvianolicacid；salvianolicacidB丹参（SalviamiltiorrhizaBge）为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，其有效成分包括水溶性和脂溶性成分。脂溶性成分主要是二萜醌类化合物（包括丹参酮、隐丹参酮等），水溶性成分主要为酚酸类化合物（包括丹参素、原儿茶醛、迷迭基金项目：广东药学院科研启动基金（43548017）2李明（1963－），女，博士，副教授。主要从事中药资源开发及利用方面的研究工作。E-mail：[e-mail];Tel:[phone]香酸、紫草酸、咖啡酸、丹酚酸(salvianolicacidA、B等）。对于丹参的水溶性酚酸类化合物，引起了医药学家的极大重视，也由于丹参的传统应用方式为水煎液，近些年来，对于其水溶性酚酸类化合物的研究较多[1，2]。丹酚酸B是目前研究较多的丹酚酸之一，在治疗心血管疾病、慢性肝炎、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化和改善记忆功能障碍等方面发挥着重要作用[3]。最新研究表明，丹参叶中的酚酸类含量与根中相似，有些甚至高于根部〔4，5〕。茉莉酸甲酯（MJ）是植物响应病原物、害虫等多种环境胁迫的共同信号分子，广泛存在于高等植物体内，并作为新型的植物激素，在调节植物生长发育、光合作用、抗逆反应等方面起着重要的作用，外施到植物体可以达到一定的逆境胁迫和调节效应[6，7]。有报道外源性MJ类化合物能有效刺激植物次生代谢物的生物合成，可引起多种植物次生产物的迅速积累[8]。目前有利用MJ研究诱导丹参毛状根中的有效成分的积累的报道[8]，本研究旨在利用MJ作为诱导子,在丹参的生产中进行田间喷施实验，探索MJ对丹酚酸B的调控机制,以及MJ在丹参生产中的应用及丹参地上部分的进一步合理开发提供研究依据。1材料与方法1.1实验材料和实验地点供试材料为丹参（SalviamiltiorrhizaBge）种苗,购于山东菏泽丹参种植基地，茉莉酸甲酯（MJ）为美国Sigma公司产品。实验地位于广东药学院大学城校区药用植物实验园。1.2实验设计及处理实验设5个处理：Ⅰ对照（丹参喷清水）；Ⅱ喷施MeJA5×10-9mol/L；Ⅲ喷施MeJA5×10-7mol/L；Ⅳ喷施MeJA5×10-5mol/L；Ⅴ喷施MeJA5×10-3mol/L。小区面积1m2，4次重复，随机区组实验设计。MeJA和清水均在出齐三片复叶时喷施，将配好的各种浓度的MJ溶液用喷壶均匀地喷到对应各组叶片上，以喷满全部叶片为度，喷后立即套上保鲜袋。喷施后48小时取样，取每铢苗的全部小叶片，将叶置60℃烘干箱烘6h，取出粉碎，过50目筛后用棕色广口瓶保存。1.3丹参总酚酸含量测定31.3.1原儿茶醛标准曲线制定原儿茶醛标准液：精密称取原儿茶醛8.50mg，加水溶解并定容至20ml（425μg/ml)，作为对照品溶液。分别精密吸取原儿茶醛对照品液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml加水至2mL，分别加0.5%NaNO25.0mL放置5min，加入10%Al(NO3)30.5ml，放置5min，加入1mol/LNaOH液5.0ml，放置10min后，以显色剂为空白，在500nm处测得吸光值。以浓度X为横坐标，吸光值Y为纵坐标，方程为y=0.0014x+0.0004，r=0.9991，线性范围为26-130μg/mL。1.3.2总酚酸的测定精密称取样品粉末0.2g，置50mL容量瓶中，加2%盐酸水溶液约12mL，浸泡15h，加酸水补足量，振摇10min，经干燥滤纸过滤，弃去初滤液，精密量取续滤液5mL，置分液漏斗中，加NaCl0.5g，乙酸乙酯萃取3次，每次5mL，水浴蒸干，残留物以无水乙醇溶解并定量转移到10mL容量瓶中，再用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，经干燥滤纸过滤，弃去初滤液，精密量取滤液1mL按原儿茶醛标准曲线测定的方法测定吸光度，计算生药水溶性总酚酸的含量。1.4丹参叶片丹酚酸B含量测定1.4.1色谱条件色谱柱：DikmaODSC184.6×250mm5μm,流动相：甲醇-乙腈-0.25%磷酸（30：10：60），流速为1ml/min，检测波长：286nm；柱温30℃。1.4.2对照品溶液的制备取丹酚酸B对照品3mg，置10ml容量瓶中，加75%甲醇适量，溶解，再用75%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。1.4.3供试品溶液的制备取丹参样品粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇溶液25mL，密塞，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用75%甲醇溶液补充丢失的溶剂量，摇匀，过滤，取滤液，即得。1.5.4线性关系考察精密称取丹酚酸B对照品溶液，分别精密吸取2µl，4µl，8µl，10µl，12µl、14µl分别进样，测定峰面积，以峰面积Y对进样量X进行线性回归，得回归方程Y=23602X-3522.4，r=0.9999；表明丹酚酸B进样量在0.604μg-3.624μg范围内与峰面积成良好的线性关系。41.5.5精密度试验取样品溶液20μl，重复进样6次。结果丹酚酸B峰面积RSD=1.25%，重复性良好。1.5.6稳定性试验取样品溶液10μL，分别在制备后0、2、4、8、12、24h测定，结果丹酚酸B峰面积RSD=1.58%，表明24h内溶液稳定。1.5.7回收率试验平行在6份样品溶液中加入丹酚酸B标准品溶液1.7ml，依法操作，测定，结果平均回收率为98.0%，RSD=1.0%。丹酚酸B的HPLC图见图1。2.结果与分析2.1不同浓度MJ对丹参地上部分水溶性总酚酸含量的影响实验结果显示（见表1），在所测试的范围内，丹参地上部分茎、叶的水溶性总酚酸含量随茉莉酸甲酯浓度的升高而增加，叶中的水溶性总酚酸含量增加的程度较茎中增加的大，如茉莉酸甲酯浓度为5×10-5M时，叶的总酚酸含量较对照增加了62％，茎中总酚酸含量较对照增加了36％；茉莉酸甲酯浓度在5×10-3条件下，叶的总酚酸含量较对照增加了100％，茎中总酚酸含量较对照增加了48％。表1不同浓度茉莉酸甲酯对丹参茎叶中总酚酸含量的影响Table1.EffectofMJonsalvianolicacidcontentinthestemsandleavesofSalviamiltiorrhiza样品号茉莉酸甲酯浓度(M)丹参水溶性总酚含量（叶）（％）（以原儿查醛计）丹参水溶性总酚含量（茎）（％）（以原儿查醛计）Ⅰ02.54±0.012.72±0.05Ⅱ5×10-93.32±0.032.91±0.01Ⅲ5×10-73.48±0.033.17±0.03Ⅳ5×10-54.09±0.023.69±0.02Ⅴ5×10-35.24±0.023.98±0.022.2不同浓度MJ对丹参地上部分丹酚酸B含量的影响实验结果（图2-6，表2）显示，在测试的范围内，丹参地上部分茎、叶的丹酚酸B含量随MJ浓度的升高而增加，其中叶的丹酚酸B含量增加的程度较茎的大，如茉莉酸甲酯浓度为5×10-5M时，叶的丹酚酸B含量较对照增加了83％，茎中丹酚酸B含量较对照增加了29％；MJ浓度在5×10-3M条件下，叶的丹酚酸B含量较对照5增加了117％，茎中丹酚酸B含量较对照增加了57％。图1.丹酚酸B对照品HPLC图谱Fig.1HPLCChromatogramofsalvianolicacidBinS.miltiorrhiza图2.样品ⅠHPLC图谱Fig.2HPLCChromatogramofS.miltiorrhizasamplesⅠ图3.样品ⅡHPLC图谱Fig.3HPLCChromatogramofS.miltiorrhizasamplesⅡ图4.样品ⅢHPLC图谱6Fig.4HPLCChromatogramofS.miltiorrhizasamplesⅢ图5.样品ⅣHPLC图谱Fig.4HPLCChromatogramofS.miltiorrhizasamplesⅣ图6.样品ⅤHPLC图谱Fig.5HPLCChromatogramofS.miltiorrhizasamplesⅤ表2.茉莉酸甲酯对丹参茎叶中丹酚酸B含量影响的测定结果Table2.EffectofMJonsalvianolicacidBcontentinthestemsandleavesofSalviamiltiorrhiza样品号茉莉酸甲酯浓度(M)叶中丹酚酸B含量（%）茎中丹酚酸B含量（%）Ⅰ00.63±0.010.66±0.04Ⅱ5×10-90.71±0.020.68±0.02Ⅲ5×10-70.95±0.020.87±0.01Ⅳ5×10-51.12±0.040.92±0.02Ⅴ5×10-31.33±0.031.10±0.022.3MJ在不同时间内对丹参地上部分水溶性总酚酸含量的影响以5×10-5M的MJ喷施丹参叶面，在不同时