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顺序号类别A申报学科代码1C03020703广东省自然科学基金自由申请项目重点项目名称：茶多酚对氧化应激损伤脑神经细胞的保护作用及机理研究申请者：所在单位：邮政编码：通讯地址：申请者电话：传真：电子邮件：申请日期：2004-3-16广东省自然科学基金管理委员会二○○一1研究内容和意义摘要氧化应激与许多疾病的发生有关。在脑神经退行性病变过程中，氧化应激导致细胞内钙稳态失调，能量代谢和信号传导障碍而发生和加重疾病。茶多酚（TeaPolyphenols,TP）是从绿茶中提取的的主要活性成分，具有明显的抗氧化应激作用。本项研究利用经典的氧化剂（如如β淀粉样蛋白，神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP），秋水仙碱等）和慢性应激等刺激，建立氧化应激整体和细胞模型，以动物学习记忆和性活动等行为指标，脑内氧化产物和抗氧化酶活性、脑细胞内钙离子浓度和细胞膜流动性等生化检测指标，细胞凋亡等细胞生物学检测指标，进行系统和比较全面的评价茶多酚抗氧化应激与减缓衰老，改善学习记忆功能，调整胞内钙离子平衡和膜流动性，减轻和降低脑细胞损伤的作用关系，为茶多酚用于防治脑神经退行性疾病奠定药理学基础。主题词（主题词应反映研究内容，主题词数量不多于三个，各主题词之间以逗号分隔）氧化应激，脑神经细胞，茶多酚2二、立论依据请按以下提纲填写：1、研究意义（对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景）2、国内外研究现状3、本项目的创新之处4、主要参考文献及出处（格式：论文——作者．题目．刊名．年份．卷(期)．页码／专著——作者．书名．出版者．年份）研究意义：氧化应激（oxidativestress）是指机体内氧自由基的产生与清除失去平衡，或外源性氧化剂的过量摄入导致活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）在体内堆积引起细胞毒性[1]。自由基氧化应激而损伤生物分子包括蛋白质、DNA和脂质过氧化，已涉入人类一些疾病的病因学[2]。已发现由氧化应激而引起的疾病有：冠心病、心肌缺血再灌注和动脉粥样硬化；神经退行性病；老年性斑变及白内障；糖尿病性微血管疾患；其他如炎症等[3，4]。其中，实验研究和临床病理检查均发现与衰老相关的中枢神经系统退行性病变，如帕金森病、老年性痴呆及多发性硬化等，它们的发病机制均与氧自由基有一定的关系[5]。因脑组织的氧代谢率极高，富含多聚不饱和脂肪酸，抗氧化能力低及再生能力差等，与机体其它组织相比脑组织更易遭受氧自由基的损伤[6]。体内存在氧化防御系统包括SOD、GSH和抗氧化营养素等对抗氧化应激反应，从而两者形成平衡关系。一旦体内产生大量的自由基未能被抗氧化剂所清除，一些重要的酶的功能就会被破坏，导致氧化应激和抗氧化防御间平衡失调，引起细胞膜多价不饱和脂肪过氧化反应。氧化应激和钙稳态失调被认为是神经原损伤死亡的关键因素，它们是急性和慢性神经退行性疾病和细胞死亡的“最后共同通路”（finalcommonpathways）。神经细胞死亡主要是不可控制的大量离子内流和细胞溶解，神经细胞凋亡主要是“死亡基因”表达增加所致。现以确定“死亡基因”的表达增加或大量离子内流入细胞，其元凶仍然是钙稳态失调和自由基生成过多。反过来，各种基因、环境因素会影响神经原的钙稳态和自由基代谢。当细胞内钙离子持续增加，并同时存在自由基时，会出现恶性前馈循环，即钙离子加速自由基生成，或反过来，自由基增加细胞内钙离子堆积[3]。如β淀粉样蛋白（Aβ）在脑内增多时，可刺激脑内胶质细胞释放TNF-α，并作用于TNF-α受体，产生大量氧自由基，促发细胞凋亡或神经退行性变。同时，Aβ促进Ca2+内流，胞内Ca2+增加，而活化calpain和caspases，促进tau蛋白磷酸化，出现神经纤维缠结、细胞凋亡或退行性变[7]。近年来研究认为线粒体在调控神经退行性病变过程中起关键作用。线粒体中的遗传基因突变、3胞内钙超载、兴奋性氨基酸释放过量、自由基（包括NO）生成过多，均能引起线粒体能量代谢障碍，神经退行性病变的发生和恶化[3，8，9]。抗氧化剂具有防止脂质过氧化以及清除和/或抑制自由基的作用，从而保护细胞，尤其是脑神经细胞，免受氧化应激的损伤，防止神经退行性疾病的发生。目前，抗氧化剂有内源性和外源性之分，内源性有酶抗氧化剂（超氧化物歧化酶SOD，谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px，过氧化氢酶CAT）和预防性抗氧化剂；外源性有天然性（食物性）抗氧化剂和药物性抗氧化剂，其中，首推是维生素E和维生素C，其抗氧化作用强而长期服用安全。食物性抗氧化剂和植物中抗氧化活性物质亦受到重视[10]。国内外研究现状：茶多酚（TeaPolyphenols,TP）是从绿茶中提取的的主要活性成分，占茶叶干重的30%，包括黄烷醇类、黄烷双醇、黄酮类和酚酸，其中黄烷醇类所占比重最大，占多酚类总量的80%，通常把黄烷醇类称为儿茶素[11]。实验表明TP在体内分布非常广泛，可进入全身各种组织，包括脑组织[12]。并对多种肿瘤，动脉硬化，心肌缺血，高血脂症，糖尿病肾病，皮肤光老化，痴呆症，巴金森症等具有防治作用，以及对免疫功能的调节作用[13，14，15，16]。其中，对神经退行性疾病的防治作用的研究已引起国内外学者的广泛关注，并开展了相应的研究工作[17，18]。实验表明TP具有保护肝脏、肾脏和脑免受脂质过氧化损伤作用[19，20]，呈剂量依赖性对抗短暂性脑缺血诱致脑细胞损伤，对脑神经细胞有保护作用[17]。对实验性动物脑缺血再灌注损伤的海马组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、Na-KATPase、Ca2+-ATPase等酶的活性均具有保护作用，同时使丙二醛（MDA）含量明显下降，并抑制大鼠大脑皮层线粒体脂质过氧化（LPO）反应和降低脑组织磷脂酶A2（PLA2）活性，增加三磷酸腺苷（ATP）酶活性和ATP含量[21，22]；体内外实验亦表明TP对氧化剂型神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）、1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）和6羟多巴胺（6-OHDA）引起的黑质部位多巴胺能神经元损毁具有明显的保护作用，其机理可能与其抑制NF-kB的移位和活化，增加DA含量和提高酪氨酸羟化酶活性，减少神经细胞对MPP+的摄取有关[18,23,24]。上述实验提示TP可能通过防止脂质过氧化以及清除和/或抑制自由基的作用，减轻脑组织的损伤[25]。体外实验表明，TP对Aβ诱致海马神经细胞的神经毒性具有保护作用，可提高神经细胞存活率,降低MDA水平和caspase活性[26]。TP的抗氧化作用特点是清除游离基或中和各种游离基引起的脂质过氧化[27，28]，抑制黄嘌呤氧化酶活性[29]，阻断iNOS和nNOS的诱导作用[30，31]。临床初试表明TP对老年性痴呆高危人群认知功能减退具有一定的防治4作用[32]。本项目创新之处：我国是茶叶生产大国，如何充分地开发和利用茶叶资源，一直是国家和政府关注的大事。上述国内外有关茶多酚的实验研究，仅侧重于某一点或某个侧面进行研究，缺乏系统的评价资料。本项目的创新之处在于利用经典的氧化剂（Aβ，MPTP,秋水仙碱等）以及慢性应激等刺激造成动物氧化应激和脑神经细胞损伤状态，通过采用整体动物模型和体外培养的大脑皮层细胞，以检测动物行为、生化改变和细胞生物学等变化，系统和比较全面地评价茶多酚对上述氧化应激损伤的脑神经细胞保护作用，并以氧化应激与细胞内钙和膜流动性及脑细胞凋亡的改变作为研究的主要目标，深入的探讨其作用机理。旨在为茶多酚作为防治早老性或血管性脑神经退行性病变的有效药物提供科学的和系统的实验资料，并为临床研究提供动物实验基础。参考文献：[1]SimonianNA,CoyleJT.Oxidativestressinneurodegenerativediseases.AnnRevOharmacolToxicol,1996,36:83-106[2]MaxwellSRJ.Anti-oxidanttherapy:doesithavearoleinthetreatmentofhumandisease?ExpOpinInvestDrugs,1997,6:211[3]张均田.老年痴呆的发病机制及防治药物.医药导报，2002，21（8）：469-471[4]MarkesberyWR.OxidativestresshypothesisinAlzheimer’sdisease.FreeRadicBiolMed,1997,23:134[5]WeberGF.Thepathophysiologyofreactiveoxygenintermediatesinthecentralnervoussystem.MedHypotheses,1994,43:223-230[6]EvansPH.Treeradicalsinbrainmetabolismandpathology.BrainMedBull,1993,49:577-587[7]YuanJ,YanknerBA.Apoptosisinthenervoussystem.Nature,2000,407:802-09[8]PukrSundvalMP,WallinC,GillandE,etal.Impairmentofmitochondrialrespirationaftercerebralhypoxiaischemiainimmaturerats:relationshiptoactivationofcaspase-3andneuronalinjury.DveBrainRes,2000,125(1-2):43[9]王来栓，于力君，张旭东等.亚低温对新生大鼠缺氧缺血脑损伤线粒体功能及凋亡的影响.复旦学报(医学版)2003,30(2)：95-98[10]陈维洲.抗氧化剂的研究和应用前景，药理学进展，科学出版社（1998）[11]GrahamHN.Greenteacomposition,consumptionandpolyphenolchemistry.PrevMed.1992,21(3):334-350[12]SuganumaM,OkabeS,OniyamaM,etal.Widedistributionof[3H](-)-epigallocatechingallate,acancerpreventiveteapolyphenol,inmousetissue.Carcinogenesis,1998,19(10):1771-6[13]SrivastavaRC,HusainMM,HasanSK,etal.Greenteapolyphenolsandtannicacidactaspotentinhibitorsofphorbolester-inducednitricoxidegenerationinrathepatocytesindependentoftheirantioxidantproperties.CancerLett,2000,153(1-2):1-5[14]MukhtarH,AhmadN.Teapolyphenols:preventionofcancerandoptimizinghealth.AmJClinNutr,2000,71(6):1698-1702[15]张素慧，吕俊华，李校坤等.茶多酚和茶色素对紫外线照射致小鼠皮肤光老化的防护作用.中国药科大学学报，2003，34（6）：561-5645[16]StonerGD,MukhtorH.Polyphenolsascancerchemopreventiveagents.J.CellBiochemSuppl,1995,22:169-80[17]S.R.,Lee,Seong-llSuh,S.P.Kim.Protectiveeffectsofthegreenteapolyphenol(-)-epigallocatechingallateagain