第五章蛋白酶溶菌酶.

第五章蛋白酶、溶菌酶（2学时）主要内容：1蛋白酶2溶菌酶1蛋白酶蛋白酶是食品工业中最重要的一类酶。在干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白质改性中都大量使用蛋白酶。人体消化道中存在的胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶使人体摄入的蛋白质水解成小分子肽和氨基酸。蛋白酶水解示意图：1.1蛋白质的特异性要求1、R1和R2基团的性质：胰凝乳蛋白酶仅能水解R1是酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸残基的侧链的肽键；胰蛋白酶仅能水解R1是精氨酸或赖氨酸残基的侧链的肽键。胃蛋白酶和羧肽酶对R2基团具有特异性要求，如R2是苯丙氨酸残基的侧链，那么这两种酶能以最高速度水解肽键。2、氨基酸构型：必须是L型的，天然蛋白质均属L型。3、底物分子大小：对于胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，底物分子大小不重要，如前述。4、X和Y性质：X、Y可以是-H、-OH，也可以继续衍生出去。（1）如果是肽链内切酶，在R1、R2能满足特异性要求的前提下，肽链就能裂开，显然X和Y必须继续衍生出去，内切酶活力才表现出最高。X、Y可以是氨基酸残基。（2）对于肽链端解酶的羧肽酶，要求底物中Y是一个-OH，其特异性对R2有严格要求。在X不是-H时，可表现高活力。（3）对于肽链端解酶的氨肽酶，要求底物中X是一个-H，优先选择Y不是-OH，特异性表现在R1上。5、对肽键的要求：大多数蛋白酶不仅限于水解肽键，尚能作用于酰胺（-NH2）、酯（-COOR）、硫羟酸酯（-COSR）和异羟污酸（-CONHOH）胃蛋白酶和其它一些酸性蛋白酶对水解键有较高识别能力。如肽键→脂键，即使R2满足要求也不能作为底物。1.2蛋白酶分类：（1）植物（2）动物（3）微生物菠萝、木瓜、无花果胃、胰蛋白酶、凝乳酶（胃）1398枯草杆菌、3942栖土曲霉蛋白酶、放线菌蛋白酶按来源分类（1）中性蛋白酶：（2）碱性蛋白酶：（3）酸性蛋白酶：pH5~81398枯草杆菌、3942栖土曲霉蛋白酶pH9~112709枯草杆菌蛋白酶pH2.5~4胃蛋白酶按作用条件分类（2）外肽酶：（1）内肽酶：产物为脲、胨、多肽、低肽羧肽酶：从以羧基末端氨肽酶：从氨基末端按对底物作用方式分类（1）丝氨酸蛋白酶（2）巯基蛋白酶（3）金属蛋白酶几乎都是内肽酶，如胰蛋白酶、凝血酶等。pH8-10如木瓜、菠萝蛋白酶，盐水失活，EDTA可激活如胰羧肽酶A，EDTA可失活根据酶活性部位分类（4）酸性蛋白酶最适pH2.5~4胃蛋白酶1.3木瓜蛋白酶：其酶活性部位中含有巯基，属巯基蛋白酶。木瓜蛋白酶存在于木瓜汁液中，分子量23900。至少有3个氨基酸残基存在于酶的活性部位，它们是Cys25（半胱）、His159（组）和Asp158（天冬）。当Cys25被氧化剂氧化或与重金属离子结合时，酶活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力。还原剂作用：从-S-S——-SH，EDTA螯合重金属离子。木瓜蛋白酶在pH5时，有良好稳定性，而在pH3或11时酶很快失活，最适pH随底物改变。木瓜蛋白酶具有较高的耐热性，酶液在pH7和70度下加热30分钟，而使牛乳凝结的活力仅下降20%。木瓜蛋白酶对酯和酰胺类底物表现出很高的活力。1.4酸性蛋白酶：（重点介绍凝乳蛋白酶）酸性蛋白酶是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位。酶的活性部位含有一个或更多的羧基。有胃蛋白酶、凝乳酶凝乳酶是存在于哺乳期小牛第四胃中的蛋白酶，以无活性的酶原形式被分泌出来。随着小牛的长大，由摄取母乳改变成青草和谷物时，凝乳酶的数量下降，而胃蛋白酶的数量增加。凝乳酶从无活性酶原转变成活性酶时经受了部分水解，分子量从36000下降到31000，pH5时酶原主要通过自身催化作用激活，而在pH2时，激活过程进行得非常快。凝乳酶在pH5.3~6.3最稳定，在pH3.5~4.5由于自我消化而失活。在中性和碱性范围，无凝乳活力。凝乳酶催化酪蛋白沉淀是干酪制造中非常重要的一步。原料乳杀菌——添加发酵剂、凝乳酶、色素——凝块形成——排除乳清——切块、搅拌、加热（CaCl20.01%）——成型压榨——腌渍——发酵成熟——上色挂蜡——成品1.5蛋白酶水解蛋白质的苦味来源：水解蛋白酶的苦味和蛋白质原有的氨基酸组成有关。特别是蛋白质中的疏水性氨基酸是导致蛋白质经水解后产生苦肽的重要原因。当蛋白质处于天然状态时，这些氨基酸埋藏在蛋白质结构的内部，因而对蛋白质的味道不会产生明显的影响。在酶水解过程中，小肽的数量将增加，从而暴露了这些疏水性氨基酸，当它们同味蕾相作用时就产生了苦味。如果采取有控制的酶水解，使蛋白质的水解反应停止在某一个阶段，使肽键具有足够的长度将疏水性氨基酸埋藏在它的结构内部，就能减少水解蛋白质的苦味。一般，20%左右的蛋白质水解，不易生成苦味肽。1.6蛋白酶作为食品添加剂的应用：1.6.1作为肉类嫩化剂菠萝炒牛肉多使用木瓜蛋白酶。从宰杀老龄的动物得到的肉类，经烧煮后口感粗糟和坚硬。肉类中存在一定数量的胶原蛋白质，胶原蛋白质中的交联数目和强度随动物年龄的增加而提高。木瓜蛋白酶作用效果从肉类感官评定和剪切力测定中可以看出。1.6.2绿茶饮料浑浊：浑浊物质主要是由蛋白质（15~65%）和多酚类化合物（10~35%），通称茶乳酪（creamy）,是绿茶饮料生产中的关键，添加木瓜蛋白酶除去绿茶浸提液中的蛋白质，对稳定绿茶饮料十分有利。1.6.3水解氨基酸的生产配制酱油主要是用蛋白质水解物做配料，蛋白质水解办法有酸解和酶解。但是盐酸水解的溶液中会带来三氯丙醇，研究证明这是一种致癌物。我国曾因酱油中检出三氯丙醇，被欧洲退货。所以要解决制取酱油三氯丙醇的问题，最好的办法是蛋白质用酶解获得水解液。2溶菌酶溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，EC3.2.1.17）又称为胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。2.1溶菌酶的发现1922年，正感冒的英国细菌学家AlexanderFleming发现，把一些鼻粘液加入细菌的培养基后会引起细胞的溶解。而这种存在于鼻粘液中的能杀死细菌的重要物质被认为是一种酶，Fleming命名其为溶菌酶（Lysozyme）。由于当时认为溶菌酶的临床价值较低，他放弃了研究，并于1928年发现青霉素。弗莱明(1881-1955)因青霉素的发现获得1945年诺贝尔奖2.2溶菌酶的来源1)2)3)植物源溶菌酶微生物源溶菌酶动物源溶菌酶鸟类、家禽的蛋清，鸡蛋清鸡含有3.5%左右的酶。哺乳动物的眼泪、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁组织细胞中(如肝、肾、淋巴组织、肠道等）目前发现含溶菌酶的植物有近170种在木瓜、无花果、大麦等植物中均已分离出溶菌酶。N-乙酰氨基己糖苷酶，破坏细菌细胞壁肽聚糖中糖苷键；酰胺酶，它催化裂解细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键；内肽酶，它催化裂解肽聚糖肽桥中的肽键。对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但其对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。溶菌酶商业制剂的最主要来源溶菌酶在生物体内的生理作用在生物体内溶菌酶具有抗菌消炎，抗病毒，增强机体免疫力的生理功能，还可激活血小板，改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，具有止血、消肿等作用。可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用。2.3溶菌酶的性质溶菌酶是由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，化学性质非常稳定。溶菌酶纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚。鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应用最多的，在鸡蛋清中约含有3.5%左右的酶，分子量为14000，（1）温度和pH的影响鸡蛋清溶菌酶最适效应温度在50℃，化学性质稳定。pH在1.2～11.3之间改变时对酶结构影响很小，在碱性环境条件下稳定性较差。pH在4～7范围内100℃处理1min仍有近100%的活力，在210℃条件下加热1.5h仍具有活性。（2）化学物质对溶菌酶的影响NaCl、糖和聚烯烃类能增加溶菌酶的热稳定性。盐溶液的存在对溶菌酶的活性是十分必要的，但在高盐浓度时溶菌酶的活性受到抑制，阳离子的价态越高则其抑制作用越强。具有-COOH和-SH3OH基的多糖对溶菌酶活性有抑制作用。（3）络合作用对溶菌酶活性的影响溶菌酶可和许多物质形成络合物导致其活性丧失。等量蛋清和蛋黄的混合物其溶菌酶无活性，脱水整蛋仅保留部分溶菌酶活性，蛋黄在pH6.2磷酸盐缓冲液中使纯溶菌酶失活。研究者认为抑制机理是在溶菌酶和蛋黄化合物间形成静电相互作用的络合物所致。N-乙酰葡萄糖胺的β(1-4)键多聚物是溶菌酶的底物。它们间形成一聚、二聚、三聚、四聚体，是溶菌酶的抑制剂。SDS结合到活性位上强烈抑制了溶菌酶活性。除此之外其它和溶菌酶形成络合物的物质有：胸腺泡核、酵母泡核、甲状腺素、甲状腺球蛋白、α-La、咪唑核吲哚衍生物。阳离子如Co2+、Mg2+、Hg2+、Cu2+等均可抑制溶菌酶的活性(10-3～10-2mol/L)。2.4溶菌酶的抗菌机理溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N-乙酰胞壁酸(NAM)的l位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子间的β-l，4糖苷键，结果使细菌细胞壁变得松弛，失去对细胞的保护作用，最后细胞溶解死亡。肽聚糖的结构对于G+细菌与G-细菌，其细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶只能破坏G+细菌的细胞壁，而对G-细菌作用不大。2.5溶菌酶在食品上的应用2.5.1溶菌酶用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜溶菌酶可作为鱼丸等水产类熟制品和香肠、红肠等肉类熟制品的防腐剂。只要将一定浓度(通常为0.05%)的溶菌酶溶液喷洒在水产品或肉类上，就可起到防腐保鲜的作用。2.5.2用于新鲜海产品和水产品的保鲜一些新鲜海产品和水产品(如：虾、蛤蜊肉等)在0.05%的溶酶菌和3%的食盐溶液中浸渍5min后，沥去水分，进行常温或冷藏储存，均可延长其储存期。2.5.3在乳制品中的应用溶菌酶在人乳中含量最高，是牛乳的3000倍，是山羊乳的1600倍，溶菌酶是婴儿生长发育必需的抗菌蛋白，在人工喂养或食用母乳不足的婴儿食品中添加溶菌酶是非常必要的。对杀死肠道腐败球菌有特殊作用，增加对感染的抵抗力。直接或间接促进婴儿肠道细菌双岐杆菌增殖促进婴儿胃肠内乳酪蛋白形成微细凝乳，有利于婴儿消化吸收；在奶酪生产中使用溶菌酶，特别是中期、长期熟化奶酪中，可以防止奶酪的后期起泡，以及奶酪风味变化，而且不影响在老化过程中的奶酪基液。溶菌酶不仅对乳酸菌生长很有利，而且还能抑制污染菌引起的酪酸发酵，这种特性为一般防腐剂不能达到的。溶菌酶还可用于乳制品防腐，尤其适用于巴氏杀菌奶，能有效地延长其保存期，由于溶菌酶具有一定的耐高温性能，也适用于超高温瞬时杀菌奶。2.5.4在糕点和饮料上的应用在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，特别是含奶油的糕点容易腐败，在其中加人溶菌酶也可起到一定的防腐作用。在pH6.0～7.5的饮料和果汁中加入一定量的溶菌酶具有较好的防腐作用。在低度酒方面的应用是日本已成功地使用鸡蛋蛋清溶菌酶代替水杨酸作为防腐剂用于清酒的防腐，其加入量为15mg/kg。此外溶菌酶还可作为料酒和葡萄酒的防腐剂和澄清剂，使用量为0.005%～0.05%。2.5.5用于制备细胞浸提物酵母膏是发酵工业中用量最多的一类培养基成分，它的制备目前大多是采用酵母自溶法或酵解酵母的方法制成的。如果改用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。也可以用溶菌酶从酵母细胞中制备呈味物质，如有些溶菌酶中除了含有溶菌酶的活性外，还可以含有能分解酵母细胞中的核酸为肌苷酸和鸟苷酸的单核酸类的呈味物质。2.5.6溶菌酶在食品包装工业中的应用将溶菌酶固定化在食品包装材料上，生产出有抗菌功效的食品包装材料，以达到抗菌保鲜功能。目前许多肉制品软包装都需要经过高温灭菌处理。经过处理的肉制品脆性变差甚至产生蒸煮味。如果在产品真空包装前添加一定量的溶菌酶(1%～3%)，然后巴氏杀菌(80～1