第五章食品毒理学实验基础.

第五章食品毒理学实验基础主要内容•第一节食品毒理学实验的原则和局限性•第二节毒理学毒性评价试验的基本目的•第三节实验动物的选择和处理•第四节食品毒理学试验设计要点•第五节实验动物的染毒和处置•第六节体外试验在毒理学中的应用•食品毒理学作为一门实验科学，以动物实验为中心。•食品毒理学研究的主要手段是动物实验。•食品毒理学动物实验的设计、实施、结果观察和评价是毒理学研究的基本方法。食品毒理学研究的主要手段是动物、实验。1.体内试验是以实验动物为模型，最终目的是通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向人(原型)外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。2.体外实验主要用于筛选和预测急性毒性和机制研究。以科学研究为目的而进行科学饲养繁殖的动物称为实验动物。★实验动物种类：常见包括：大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、狗、猫、猴、小型猪、鸡、青蛙、蟾蜍、鱼类等。•豚鼠：特点是毛短而光滑，生长快，抗病力强，繁殖性能好。广泛用于药物学、传染病学、免疫学、营养学、耳科学等各项医学及生物学的研究中。•SD大鼠：白色，产仔多，生长发育较Wistar大鼠为快，对疾病的抵抗力尤以呼吸道疾病的抵抗力强。自发肿瘤发生率较低，对性激素感受性高。•BALB/c小鼠：对致癌因子敏感，对放射性照射极为敏感。生产性能良好，繁殖期长，广泛应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学和单克隆抗体等研究。意义:•实验动物是生命科学（生物、医学、食品等）研究的重要基础和支撑条件，在科研、教学、生产、检定、安全评价和成果评定中都离不开实验动物，被称为“活的仪器、活试剂”。•英国一位科学家曾这样比喻：“在生命科学研究中使用实验动物就象在分析化学中使用分析天平一样重要”。•落户武汉大学实验动物中心的慰灵碑，旨在纪念在抗非典疫苗和药物实验中为人类健康献身的38只恒河猴第一节食品毒理学实验的原则和局限性食品毒理学实验的原则化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人实验动物必须暴露于高剂量成年的健康实验动物(雄性和雌性未孕)和人可能的暴露途径是基本的选择代表性、可重复性化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人①人是最敏感的动物物种；②人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重(或体表面积)相关。这两个假设也是全部实验生物学和医学的前提。以单位体表面积计算在人产生毒作用的剂量和实验动物通常相近似。而以体重计算则人通常比实验动物敏感，差别可能达10倍。因此可以利用安全系数来计算人的相对安全剂量。第二个原则是实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需的和可靠的方法。•毒理学试验中，一般要设3个或3个以上剂量组，以观察剂量-反应(效应)关系，确定受试化学物引起毒效应及其毒性参数。•引起毒效应的最低剂量(LOAEL)与人的暴露剂量接近时，说明该化学物不安全。当该剂量与人的暴露剂量有很大的距离(几十倍，几百倍或以上)，才认为具有一定安全性，此距离越大，安全性越可靠。第三个原则，成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物和人可能的暴露途径是基本的选择。•不能重复的实验结果是没有任何科学价值的。选用成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物是为了使实验结果具有代表性和可重复性。•以成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物作为一般人群的代表性实验模型，而将幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作为特殊情况另作研究。这样可降低实验对象的多样性，减少实验误差。食品毒理学实验的局限性用实验动物的毒理学实验资料外推到人群接触的安全性时，会有很大的不确定性实验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同，有时甚至存在着质的差别高剂量向低剂量外推的不确定性小数量实验动物到大量人群外推的不确定性成年健康动物与不同的人种、种族，而且包括年老体弱及患病的个体之间的易感性不同•首先，实验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同，有时甚至存在着质的差别。虽然在毒理学实验中通过用两种或两种以上的动物，并尽可能选择与人对毒物反应相似的动物，但要完全避免物种差异是不可能的。而且在动物实验中，可观察到体征(sign)，而没有症状(symptom)。实验动物不能述说涉及主观感觉的毒效应，如疼痛、腹胀、疲乏、头晕、眼花、耳鸣等，这些毒效应就难以或不可能发现。第二，高剂量向低剂量外推的不确定性在毒理学实验中，为了寻求毒作用的靶器官，并能在相对少量的动物上就能得到剂量-反应或剂量-效应关系，往往选用较大的染毒剂量，这一剂量通常要比人实际接触的剂量大得多。有些化学物在高剂量和低剂量的毒性作用规律并不一定一致，如大剂量下出现的反应有可能是由于化学物在体内超过了机体的代谢能力，这就存在高剂量向低剂量外推的不确定性。第三，毒理学实验所用动物数量有限，那些发生率很低的毒性反应，在少量动物中难以发现。而化学物一旦进入市场，接触人群往往会很大。这就存在小数量实验动物到大量人群外推的不确定性。•四，实验动物一般都是实验室培育的品系，一般选用成年健康动物，反应较单一，而接触人群可以是不同的人种、种族，而且包括年老体弱及患病的个体，在对外源化学物毒性反应的易感性上存在很大差异。第二节毒理学毒性评价试验的基本目的包括以下几点：受试物毒作用的表现和性质剂量-反应(效应)研究，可以得到该受试物的多种毒性参数确定毒作用的靶器官确定损害的可逆性•1.受试物毒作用的表现和性质。在急性和慢性毒性试验中，观察受试物对机体的有害作用，对有害作用的观察应该是对每个实验动物进行全面的逐项的观察和记录。发现有害作用是进行剂量-反应(效应)研究的前提。•2.剂量-反应(效应)研究。剂量-反应(效应)研究是毒性评价和安全性评价的基础。•在急性(致死性)毒性试验中，应该得到LD50（半数致死剂量/浓度），也可以得到LD01（最小致死剂量或浓度）和MTD（最大耐受剂量或浓度）。•在急性非致死性毒性试验中，可应该得到急性可观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量(NOAEL)。•在亚急性、亚慢性及慢性毒性试验中，可得到相应的LOAEL和NOAEL。•在致突变、致癌和致畸等特殊毒性试验中，剂量-反应(效应)研究将为确定受试物是否具有这些特殊毒性提供依据。在致畸试验也可得到LOAEL和NOAEL；在致突变、致癌试验中，尽管认为是无阈值的，但也可得到表观的LOAEL和NOAEL。•3.确定毒作用的靶器官。确定受试物有害作用的靶器官，是毒理学研究的重要目的，以阐明受试物毒作用的特点，并为进一步的机制研究和毒性防治提供线索。4.确定损害的可逆性。•一旦确认有害作用存在，就应研究停止接触后该损害是否可逆和消失，器官和组织功能是否能恢复，还是像化学致癌作用那样停止接触后损害继续发展？•毒性的可逆性关系到对人的危害评价，如果受损的器官组织能够修复并恢复正常功能，则可能接受较高危险性的接触水平。描述性动物毒性实验•1、急性致死性毒性实验•2、皮肤和眼刺激试验•3、致敏试验•4、亚急性（重复剂量）毒性试验•5、亚慢性毒性试验•6、慢性毒性试验•7、发育和生殖毒性试验•8、致突变试验•急性致死性毒性实验•对新化合物首先进行的第一个试验，是使用一种或一种以上的动物，通过一种或一种以上的途径（其中一种途径为经口途径，或其他有意摄入的途径）测定LD50和其他毒效应的试验。最常使用的动物是小鼠和大鼠，但有时也用家兔和狗。受试动物包括雌雄两性成年动物，染毒前往往隔夜禁食。记录一次染毒后14天内动物死亡的数目。除死亡和体重改变外，每天还要观察受试动物的中毒症状、活动状况、行为改变、患病情况、食物利用率等。•亚慢性毒性试验•染毒期限有时不同，最常采纳的实验期限是90天。最主要目的是确定“无可观察到作用剂量（NOAEL）”，并进一步确认重复染毒情况下，受试物毒作用的特异靶器官。除受试物种的NOAEL外，还可获得“观察到有害作用的最小剂量（LOAEL）”。•亚慢性毒性试验一般选择2种动物（大鼠和狗），采用与预定实际接触相一致的染毒途径（常为经口途径）。•慢性毒性试验•除了实验期限超过3个月以外，长期或慢性毒性试验的进行在其他方面都类似于亚慢性实验。慢性毒性试验染毒期间对啮齿类一般为6个月至2年的时间，对非啮齿类通常为1年甚至更长。染毒持续时间在某种程度上取决于人类实际接触时间。•目的是评价化学物的蓄积毒性。•致突变试验•致突变作用是化学物引起细胞核遗传物质发生改变的能力。这种改变是可以通过细胞分裂传递给下一代细胞的。突变可以发生于两种类型的细胞，产生本质上不同的后果。•生殖细胞突变：引起精细胞和卵细胞的DNA损伤，并可通过减数分裂将突变遗传到子代细胞。•体细胞突变是指发生在精、卵细胞以外所有其他种类细胞的突变。体细胞突变是不遗传的，但可以通过有丝分裂将遗传缺陷传递给同一组织的其他细胞，也可能引起细胞死亡。第三节实验动物的选择和处理1、实验动物物种的选择基本原则选择对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种自然寿命不太长的物种易于饲养和实验操作的物种经济并易于获得的物种目前常规选择物种的方式是利用两个物种，一种是啮齿类，另一种是非啮齿类。系统毒性研究最常用的啮齿类是大鼠和小鼠，非啮齿类是狗。豚鼠常用于皮肤刺激试验和致敏试验。兔常用于皮肤刺激试验和眼刺激试验。遗传毒理学试验多用小鼠，致癌试验常用大鼠和小鼠，致畸试验常用大鼠、小鼠和兔。迟发性神经毒性试验常用母鸡。常用实验动物生物学和生理学参数参数猴狗猫兔大鼠小鼠豚鼠地鼠成体体重(kg)3.514.03.33.70.450.0350.430.12寿命(a)161514631.531水消耗(ml/d)45035032030035614530饲料消耗(成本g/d)1504001001801051210成体代谢(cal／kgd)1588080110130600100250体温(℃)38.838.938.639l438l237.438.638.0呼吸频率50202553851609083(次／min)(40～60)(10～30)(20～30)(40～65)(65～110)(80～240)(70～100)(35～130)心率(次／min)200100120200328600300450血压mmHg(收缩／舒张)159/127148/100155/100110／80130/90120／7577/50108/77出生体重(g)500~7001100~22001251005-61.575~1002.0断乳时体重(g)440058003000100~150040~5010~1225035参数猴狗猫兔大鼠小鼠豚鼠地鼠妊娠(d)16863633121206716性周期(d)282215～2815～164～54～516～194动情期(d)1～27～139～19301111窝数量13～61～61～136～91～121～51～12断乳年龄(周)16～2466～983～4323～4生殖年龄(月)549106～72～3232生殖期(年)10～155～1041～31131生殖季节任何时间春，秋冬季2～3个月任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间所需面积(tf2)*68330.40.40.70.34环境温度(℃)18～2818～2818～2818～2819～2519～2519～2519～25血容量(mL/Kg)7579605365807585凝血时间(s)90180120300601460143HCT(％红细胞)4245404246414250Hb(g／bl)12.516.011.813.614.816.012.412.02、实验动物品系的选择品系(strain)指用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。实验动物按遗传学控制分类可分为：–①近交系：指全同胞兄妹或亲子之间连续交配20代以上而培育的纯品系动物。如小鼠有津白I、津白Ⅱ、615，DBA／1和DBA／2，BALB/C，C3H，C57B／6J，A和A／He等。–②杂交群动物(杂交1代，F1)，指两个不同的近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物。–③封闭群：一个种群在五年以上不从外