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PROTEINENGINEERING蛋白质工程21.全球生物制药的市场快速增长，目前已达1970亿美元，其中重组蛋白和抗体类药物占绝大部分。2.截止到2012年，在欧洲或美国获准上市的430多种生物药品中，超过300种是重组蛋白和抗体药物。3.据统计，截止2013年，超过900种基于蛋白和多肽类的药物正处于研究和开发阶段，用于治疗超过100种疾病。生物制药与蛋白质工程具备的知识基础：分子生物学、分子遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学、基因工程等蛋白质工程本课程共48学时：闭卷考试+课堂表现3课程的主要任务：1．掌握蛋白质工程的基本原理、基础知识、基本技能2．熟悉蛋白质工程研究的主要方法和技术3．了解蛋白质工程领域的研究方向与最新科技成果蛋白质工程4第一章绪论第二章蛋白质结构基础第三章蛋白质分子设计第四章蛋白质的修饰和表达第五章蛋白质的结构解析第六章蛋白质的分离与纯化第七章蛋白质组学与生物信息学第八章蛋白工程的应用蛋白质工程5绪论教学内容：蛋白质工程的基本概念蛋白质工程的产生蛋白质工程的研究内容蛋白质工程的应用及意义6一、蛋白质工程的概念工程化：理念－设计－制造－功能实现以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。7蛋白质工程是指通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究，获取有关蛋白质物理和化学等各方面的信息，在此基础上利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造并分离、纯化蛋白质，从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的过程。被称为“第二代基因工程”蛋白质工程的概述8二、蛋白质工程的诞生1983年，美国生物学家Ulmer博士在《Science》上发表了以“ProteinEngineering”为题的专论，首次明确提出蛋白质工程的概念，标志着蛋白质工程的诞生。Ulmer,K.M.(1983)“ProteinEngineering”,Science,219:666-671.Theprospectsforproteinengineering,includingtherolesofx-raycrystallography,chemicalsynthesisofDNA,andcomputermodellingofproteinstructureandfolding,arediscussed.---Deliberatedesignandproductionofproteinswithnoveloralteredstructureandproperties,thatarenotfoundinnaturalproteins.9比较1：新蛋白的产生蛋白质工程产生新的蛋白质（工程）自然界中产生新的蛋白质（进化）都是产生了变异，但蛋白质工程速度比自然进化快10基因工程蛋白质工程相同点都要改造基因，都属于分子水平产生的基因（型）无新基因（型）有新基因（型）产生的蛋白质原有的新的联系蛋白质工程以基因工程为基础，是基因工程的应用和延伸比较2：基因工程和蛋白质工程11比较3：酶工程与蛋白质工程的区别酶工程：将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用和大量制备。蛋白质工程：重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。12二、蛋白质工程的产生与发展为什么要进行？（需求）如何能进行？（支撑条件）何时崛起？13需要是创新的第一动力，需求是发明创造的源泉和方向，而科学的知识是发明创造的工具。14medication1、DEMANDS蛋白质药物的稳定性半衰期不良反应免疫原性15CatalystforindustriesDEMANDS热稳定性化学稳定性压力稳定性催化效率16AgricultureDEMANDS生物学活性稳定性Cow-HenryfromRoslinInstituteMilkwithhighconcentrationofa1-antitrypsin17FrancisCrick,JamesWatson,19621968RobertHolley,GobindKhorana,MarshallNirenberg1933ThomasHuntMorgan182、生物技术的发展WernerArber,1978,restrictionenzymesMichaelSmith,1993,PointmutationFrederickSanger,1980,DNASequencingSeveroOchoa,1959,SynthesisofRNAKaryB.Mullis,1993,PCR19GeraldM.Edelman,1972,AntibodystructureFrederickSanger,1958,StructureofinsulinBruceMerrifield,1984,PeptideSynthesis20JohnB.Fenn,KoichiTanaka,KurtWüthrich,2002,MassandNMRHerbertA.Hauptman,JeromeKarle,1985,X-RayCrystal21蛋白质工程诞生的基础1）新的克隆技术，特别是完整的cDNA克隆技术；2）快速测定DNA序列测定；3）从DNA序列推算蛋白质顺序的较好的计算机程序；4）蛋白质顺序数据库的建立，使一级结构相似的蛋白能被很快地鉴定出来，并由此研究其功能上的相似性；5）对原核生物和真核生物基因表达调控的进一步深入了解；6）用基因体外诱变的化学、酶学和合成技术的进展；7）X光晶体学的进展，包括较好的长浸提策略，同步辐射的应用，电子区域检测器的出现，以及计算机辅助的数据分析；8）用计算机图像系统为工具直接观察晶体数据；9）核磁共振技术的改进，使溶液中原子分布能得到直接检测。223、蛋白质工程产生的标志1982年，Winter等首次报道了通过基因定位诱变获得改性的酪氨酸tRNA合成酶(Nature,299,1982)1983年，美国的Ulmer在《Science》上首先提出了“ProteinEngineering“——蛋白质工程诞生(Science,219:666-671.)23DESIGNandPRODUCEBETTERPROTEINSBIOCHEMICALSTRUCTUREFOLDDINGTHERMODYNAMIC244、蛋白质工程与其他技术相互渗透（1）蛋白质工程与发酵工程发酵工程可以利用基因技术和细胞杂交技术选育出一大批生长速度快、代谢能力强、易于大量表达外源产物的新菌种，可为蛋白质工程提供优良稳定的工程菌株，并可为蛋白质工程中前期材料的制备等奠定重要基础。25（2）蛋白质工程与基因工程蛋白质工程是从DNA水平改变基因入手，通过体外重组技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能新蛋白质的新兴研究领域，也就是说蛋白质的改造通常需要经过周密的分子设计，进而依赖基因工程获得突变型蛋白质。目前，基因工程已为实现蛋白质工程提供了基因克隆、表达、突变及活性检测等关键技术。26（3）蛋白质工程与细胞工程细胞工程是指以细胞为单位，在细胞和亚细胞水平上有目的地进行遗传操作，通过细胞融合、核移植等方法，培养出人们需要的新物种，克服了源远杂交的局限性。目前，细胞工程技术已为蛋白质工程提供了改良性状的微生物细胞以及稳定的动植物细胞系，以便更好的生产蛋白质；另外，细胞工程可通过细胞融合、转基因技术改变生物的遗传性状或实现新型生物的构建，进而为蛋白质的生产提供更多良好的载体。27（4）蛋白质工程与酶工程由于大部分酶的化学本质是蛋白质，因此酶工程与蛋白质工程的发展密不可分。（5）蛋白质工程与生物信息技术利用生物信息学可以进行蛋白质结构的预测，其目的就是利用已知的一级序列来构建蛋白质的立体结构模型。281）蛋白质结构分析2）蛋白质结构预测3）改造或创造新蛋白质三、蛋白质工程的研究内容29每一种蛋白质有自己独特的aa顺序，蛋白质功能部位的几个aa残基决定着蛋白质的功能，这几个负责功能的aa残基必须处于一个及其精密的空间状态下才能发挥功能。这就是说，只要能维持蛋白质结构域的必需aa及空间构象不变，其功能域的生物学活性就会保持不变。所以只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能通过改变aa达到改造蛋白质的目的。1、蛋白质结构分析301、蛋白质结构分析（研究核心）1）收集大量的蛋白质分子结构的信息2）建立结构与功能之间关系的数据3）蛋白质结构与功能之间关系的理论研究三维空间结构的测定是证明新结构改变了原有生物功能的必需手段31主要事件：1934年，胃蛋白酶的x射线衍射照片J.Bernal,D.Crowfoot1957年，肌红蛋白晶体结构Kendrew1959年，血红蛋白晶体结构Perutz32晶体学技术（x射线晶体结构分析）：1.对原材料的要求：具有高度的均一性；影响因素有金属离子、辅酶或一些成键的辅助集团的变化或缺失；蛋白质的酶解、氧化和还原；蛋白质的聚合效应等2.晶体生长的生化条件：pH值、离子强度、沉淀剂和添加剂的浓度等因素缺陷需要分离出足够量的纯蛋白质（几毫克-几十毫克），制备出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析蛋白质结构分析主要技术33多维核磁共振波谱技术：二维同核核磁共振方法：对氢原子核的二维核磁共振信号进行分析，主要用于β类蛋白质多维异核核磁共振方法：1H、13C、15N，主要用于分子量高于10kDa的蛋白质和α螺旋的多肽冷冻电镜技术:避免了普通电镜制样的脱水过程，不破坏蛋白正常结构并且分辨率更高，尤其适用于大分子蛋白复合体的结构解析蛋白质结构分析主要技术3435施一公1.StructureofaYeastSpliceosomeat3.6AngstromResolution,10.1126/science.aac76292.Structuralbasisofpre-mRNAsplicing.10.1126/science.aac8159蛋白质空间结构的测定已经成为生命科学的“瓶颈”美国NIH投资1.25亿美元，计划测定1万个蛋白质晶体结构；日本RIKEN将建16台高分辨率核磁共振仪，用来测定小分子蛋白质结构技术上的障碍：在克隆、表达、纯化和结晶过程中，大约20个蛋白质中能得到1个可供结构测定的晶体，并且一些蛋白质（膜蛋白）根本不可能被结晶现阶段主要研究手段：根据氨基酸序列从理论上计算其相应空间结构成为蛋白质领域内科学家们的奋斗目标研究现状361）蛋白质结构分析2）蛋白质结构预测3）改造或创造新蛋白质三、蛋白质工程的研究内容372、结构预测对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构381、理论分析方法或从头算方法(Abinitio)：该类方法假设折叠后的蛋白质取能量最低的构象2、统计方法：对已知结构的蛋白质进行统计分析，建立序列到结构的映射模型，进而根据映射模型对未知结构的蛋白质直接从氨基酸序列预测结构。这一类方法包括经验性方法、结构规律提取方法、同源模型化方法等2、结构预测39生物信息学分析技术蛋白质结构的预测和设计40主要技术：分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能研究现状：尚在起步阶段411）蛋白质结构分析2）蛋白质结构预测3）改造或创造新蛋白质三、蛋白质工程的研究内容42蛋白质分子设计按照被改造部位的多寡分为三种类型：3）改造或创造新蛋白质“大改”，即在了解蛋白质结构和功能的基础上，从一级结构出发，设计自然界不存在的全新蛋白质。“小改”：对已知结构的蛋白质进行几个残基的替换来改善蛋白质的结构和功能；“中改”：对天