草菇纤维素酶活测定实验方案(终)

1第三章草菇纤维素酶活性测定3.1草菇菌丝培养3.1.1培养基类型：A:固体平板培养基：PDAB:液体培养基：基础培养基+2%葡萄糖C:种子培养基：基础培养基+1%甘油D:诱导产酶培养基：基础培养基+1%诱导物基础培养基basalmedium（g/L）：KH2PO41.0、K2HPO40.4、MgSO4·7H2O0.5、CaCl2·2H2O0.013、Yeastextract0.1、L-asparagine1.5、NH4NO30.5、thiamine·HCl0.0025(sterilizedbyfiltrationandaddedafterautoclavingofothermediumcomponents)、Tween800.2%(vol/vol)、Mineralsolution0.1%；终pH用2MKOH调至6.2，高压灭菌15-20min。配置：0.25g溶于100ml水中，配成2.5mg／ml的Thiamine·HCI溶液，过滤除菌。每个液体诱导培养三角瓶加0.1ml。配置：Mineralsolution(g/L)：柠檬酸铁FeC6H5O74.8、ZnSO4·7H2O2.64、MnCl2·4H2O2.0、氯化钴CoCl2·6H2O0.4、andCuSO4·5H2O0.4。配置100ml。3.1.2诱导物类型：诱导物：a:羧甲基纤维素钠(cabroxymethylcellulose)CMC1%b:纤维二糖cellobioseC.bi2%c:α-乳糖α-lactoseα-L0.5%d:微晶纤维素MicrocrystallinecelluloseM.C1%e:定量滤纸FilterpaperF.P1%3.1.3草菇诱导产酶培养将PYD15、PYD21、H1521用薄的PDA固体平板培养。32℃下培养7d。接种到加葡萄糖的基础培养基中，32℃，150rpm振荡培养7d。取相同体积的菌丝接种到甘油培养基中，32℃，150rpm振荡饥饿培养48h。将相同容积的菌丝体接种到D诱导产酶培养基中。32℃，150rpm液体振荡2培养48h。同时收集三个样品菌液和菌丝。并将菌丝放入液氮中保存备用。技术路线如下：药品配置：DNS试剂(GB)：称取3,5-二硝基水杨酸(10.0)g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。DNS试剂（Y.H.PercivalZhang）：称取DNS10.6g，NaOH19.8g完全溶于1,416mL水中。再依次加入酒石酸甲钠360g、7.6ml融化的苯酚(50℃)和8.3g焦亚硫酸钠。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。磷酸缓冲液(GB)：0.1mol/LpH6.0(适用于中性纤维素酶)分别称取一水磷酸二氢钠121.0g和二水磷酸氢二钠21.89g，将其溶解在10L去离子水中。调节溶液的pH到6.0备用。溶液在室温下可保存一个月。磷酸缓冲液(实际配制)：A：0.2mol/L磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠-十二水71.64g，定容至1000ml。A:固体平板培养基B:液体培养基：基础培养基+2%葡萄糖C:种子培养基：基础培养基+1%甘油D:诱导产酶培养基：基础培养基+1%诱导物菌丝酶液一分为二称重量测胞内酶活硫酸铵沉淀透析胞外酶活缓冲液溶解液氮研磨提RNA诱导物CMC1%M.C.1%F.P.1%C.bi2%α-L0.5%用固定容积滤网，过滤3B：0.2mol/L磷酸二氢钠：称取磷酸二氢钠-二水31.21g，定容至1000ml。A液：12.3；B液：87.7。配成0.2M的母液，加1倍水即为0.1M缓冲液。葡萄糖标准贮备溶液制备（10mg/ml）：称取于(103±2)℃下烘干至恒重的无水葡萄糖1g,精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL。标准曲线的制备：分光光度计、恒温水浴、计时器、沸水浴、试管架、20ml具塞试管、擦镜纸、1ml移液枪、枪头葡萄糖标准使用溶液分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00mL于50ml离心管中，定容至10mL，摇匀。绘制标准曲线：管号葡萄糖标准使用液缓冲液吸取量mlDNS吸取量ml葡萄糖含量（mg）吸光度A浓度mg/ml吸取量ml00.00.003.02.00.0010.20.502.52.00.1020.40.502.52.00.2030.60.502.52.00.3040.80.502.52.00.4051.00.502.52.00.5061.20.502.52.00.6071.50.502.52.00.7582.00.502.52.01.0092.50.502.52.01.25103.00.502.52.01.50113.50.502.52.01.75124.00.502.52.02.00将标准管同时置于沸水浴中，反应5min。取出，迅速冷却至室温，用水定容至20mL。盖塞，混匀。波长520nm处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。3.2酶活测定仪器：纱布、烧杯（过滤用）、液氮、研钵、研磨棒、离心管、滤纸4透析袋的预处理：在200mL的2%碳酸氢钠和1mM的EDTA溶液中煮沸10min。再用蒸馏水彻底洗涤后再放在1mM的EDTA溶液中煮沸10min。最后蒸馏水煮沸冲洗后4℃蒸馏水中存放。使用前用蒸馏水清洗透析袋内外，操作时用镊子或戴手套。透析到氯化钡溶液滴入烧杯中不形成白色浑浊。将透析袋埋入聚乙二醇-10000中浓缩酶液。3.2.1样品酶液制备3.2.1.1胞外酶液的制备将草菇的液体诱导培养液，用纱布过滤。分别保留滤液和菌丝体。将滤液加入20%的硫酸铵在4℃下静置几小时，然后4℃10000rpm离心20min后收集上清（50ml离心管）。再缓慢加入60%的硫酸铵（*0.6g硫酸铵）4℃盐析12h，然后4℃、12000rpm离心20min。将沉淀溶于7ml的缓冲液，透析袋4℃透析20h，到BlCl2检验无沉淀后，用PEG20000吸水后，得浓缩酶液，作为胞外酶液，用于测定胞外纤维素酶活。3.2.1.2胞内酶液的制备将过滤所得的菌丝体，用预冷的缓冲液冲洗几次后，滤纸吸干，称重，并记录。准确称取1g菌丝，液氮研磨后，转移至洁净离心管中，加5ml缓冲液，10,000rpm离心2～3min，再将上清转移至新离心管，加PMSF至终浓度1～2mmol/L，所得溶液作为胞内酶液，用于测定胞内纤维素酶活。3.2.2草菇纤维素酶总活力测定3.2.2.1滤纸酶活力法（FPUAssay）底物：WhatmanNo.1号滤纸（日本用东洋1号），1.0×6.0cm(≌50mg)。方法：样品管：酶+底物+DNS空白管：缓冲液+DNS酶对照管：酶+DNS底物对照管：底物+DNS1．取4支20ml刻度具塞试管，标号。2.按对应加入卷滚的FP和1ml缓冲液。50℃水浴预热30min。3.准确加入待测酶液2ml，混匀，盖塞。4.置于50℃水浴中，不时振荡，反应120min，取出。5.立即加DNS试剂2mL。摇匀。6.同时放入沸水浴中，准确沸腾5min，取出，冰水浴冷却。57.用去离子水定容至20mL。以空白管调零，520nm下测量吸光度值。FA酶活力按下式计算：吸光度=样品管-酶对照管-底物对照管X=A×l/2×n×1/2式中：X—酶活力(CMCA-DNS)，u/g(或u/mL)；A—根据吸光度在标准曲线上计算出的还原糖量，mg；1/2—换算成酶液1mL；n—酶样的稀释倍数；1/2—时间换算系数。3.2.3草菇纤维素酶家族的各组分酶活力测定3.2.3.1内切葡聚糖酶endocellulase(EC3.2.1.4)（EG或CX）活力测定底物：1%羧甲基纤维素钠CMC-Na溶液方法：样品管：酶+底物+DNS空白管：缓冲液+DNS酶对照管：酶+DNS底物对照管：底物+DNS1．取4支20ml刻度具塞试管，标号。2.按对应加入1ml底物CMC-Na溶液。50℃水浴预热30min。3.准确加入待测酶液2ml，混匀，盖塞。4.置于50℃水浴中，不时振荡，反应120min，取出。5.立即加DNS试剂2mL。摇匀。6.同时放入沸水浴中，准确沸腾5min，取出，冰水浴冷却。7.用去离子水定容至20mL。以空白管调零，520nm下测量吸光度值。CMC酶活力按下式计算：吸光度=样品管-酶对照管-底物对照管X=A×l/2×n×1/2式中：X—酶活力(CMCA-DNS)，u/g(或u/mL)；A—根据吸光度在标准曲线上计算出的还原糖量，mg；1/2—换算成酶液1mL；6n—酶样的稀释倍数；1/2—时间换算系数。3.2.3.2外切葡聚糖酶exocellulase(EC3.2.1.91)（CBH，EC或C1）活力测定底物：0.5%微晶纤维素(MC)溶液。方法：样品管：酶+底物+DNS空白管：缓冲液+DNS酶对照管：酶+DNS底物对照管：底物+DNS1．取4支20ml刻度具塞试管，标号。2.按对应加入1ml底物MC溶液。50℃水浴预热30min。3.准确加入待测酶液2ml，混匀，盖塞。4.置于50℃水浴中，不时振荡，反应120min，取出。5.立即加DNS试剂2mL。摇匀。6.同时放入沸水浴中，准确沸腾5min，取出，冰水浴冷却。7.用去离子水定容至20mL。以空白管调零，520nm下测量吸光度值。EC酶活力按下式计算：吸光度=样品管-酶对照管-底物对照管X=A×l/2×n×1/2式中：X—酶活力(CBH)，u/g(或u/mL)；A—根据吸光度在标准曲线上计算出的还原糖量，mg；1/2—换算成酶液1mL；n—酶样的稀释倍数；1/2—时间换算系数。3.2.3.3β-葡糖苷酶beta-glucosidase(EC3.2.1.21)（CB，或纤维二糖酶Cellobiase）活力测定底物：纤维二糖（cellobiose）15mM。pNPG(p-Nitrophenyl-β-D-Glucoside)5mM。方法：样品管：酶+底物+DNS7空白管：缓冲液+DNS酶对照管：酶+DNS底物对照管：底物+DNS1．取4支20ml刻度具塞试管，标号。2.按对应加入1ml底物CB溶液。50℃水浴预热30min。3.准确加入待测酶液2ml，混匀，盖塞。4.置于50℃水浴中，不时振荡，反应120min，取出。5.立即加DNS试剂2mL。摇匀。6.同时放入沸水浴中，准确沸腾5min，取出，冰水浴冷却。7.用去离子水定容至20mL。以空白管调零，520nm下测量吸光度值。CB酶活力按下式计算：吸光度=样品管-酶对照管-底物对照管X=A×l/2×n×1/2式中：X—酶活力(CB)，u/g(或u/mL)；A—根据吸光度在标准曲线上计算出的还原糖量，mg；1/2—换算成酶液1mL；n—酶样的稀释倍数；1/2—时间换算系数。3.3平板测定刚果红透明圈法：配制质量浓度为10mg／mL的刚果红溶液，灭菌后，按照每200mL培养基加入1mL的比例加入刚果红溶液，混匀后倒平板。等培养基上长出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。Gram’siodine:CMCagar(0.2%NaNO3,0.1%K2HPO4,0.05%MgSO4,0.05%KCl,0.2%CMC,0.02%peptone,1.7%agar.Gram’siodine(2.0gKIand1.0giodinein300mldistilledwater)3to5minutesThestandardcellulase:Aspergillusniger