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蛋白质工程Ⅰ（ProteinEngineering）生物技术学院宁云山Protein(Native)ProteinEngineering蛋白质工程应怎样的需求而崛起的？1972年，美国斯坦福大学Berg成功地实现了DNA重组实验——基因工程诞生20世纪80年代初，蛋白质晶体学和结构生物学发展1982年，Winter等首次报道了通过基因定位诱变获得改性的酪氨酸tRNA合成酶1983年，美国的Ulmer在《Science》上首先提出了“ProteinEngineering“——蛋白质工程诞生DEDIGNINGBETTERPROTEINTHERMODYNAMICBIOCHEMICALSTRUCTURFOLDDINGCatalystforindustriesAgriculturemedicationAPPLICATION蛋白质工程的基础------蛋白质的物理和化学性质蛋白质结构基础——化学组成均含有C(50～55%)、H(5.0～7.0%)、O(20～23%)、N(15～17%)及少量的硫(0.3～2.5%),以一定的比例存在。有些含有微量的金属元素，如铁、锌、钼、镍等。分子质量均在10000Da以上，变化范围从10000～1000000Da。易被酸、碱和蛋白酶催化水解为胨、肽。除脯氨酸外，所有氨基酸均可表示为：非极性氨基酸Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、His、Tyr、Trp不带电荷的极性氨基酸Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Met带正电荷的碱性氨基酸Arg、Lys带负电荷的酸性氨基酸Asp、Glu氨基酸名称英文缩写简写氨基酸名称英文缩写简写甘氨酸GlyG丝氨酸SerS丙氨酸AlaA苏氨酸ThrT缬氨酸ValV天冬酰胺AsnN异亮氨酸IleI谷酰胺GlnQ亮氨酸LeuL酪氨酸TyrY苯丙氨酸PheF组氨酸HisH脯氨酸ProP天冬氨酸AspD甲硫氨酸MetM谷氨酸GluE色氨酸TrpW赖氨酸LysK半胱氨酸CysC精氨酸ArgR20种标准氨基酸的英文简写蛋白质结构基础——氨基酸的物理性质无色结晶，各有特殊晶型，熔点极高，一般在200～300℃左右，常用于定性鉴定。含有氨基和羧基，既可接受质子，又可释放质子，属于两性电解质。每种氨基酸具有特定的等电点（pI）。当溶液的pH某氨基酸的pI时，该氨基酸带正电荷当溶液的pH某氨基酸的pI时，该氨基酸带负电荷分离混合氨基酸蛋白质的一级结构（primirystructure）多肽链中氨基酸的排列序列人胰岛素的一级结构蛋白质的二级结构(secondarysturcture)多肽链主链骨架中的若干肽段，各自沿着某个轴盘旋或折叠，并以氢键维系，从而形成有规则的构象，不涉及氨基酸残基的侧链构象。α-螺旋（α-helix）β-折叠(β-sheet)β-转角(β-turn)β-凸起（β-burgle）无规则卷曲（randomcolix）4种α-螺旋结构（α-helix）β-折叠(β-sheet)在平行（a）和反平行（b）β－折叠片中氢键的排列β-转角(β-turn)β-凸起（β-burgle）无规则卷曲（randomcoil)三级结构（tertiarystructure）在二级结构的基础上再折叠ABCA胰岛素的三级结构B溶菌酶分子的三级结构C磷酸丙糖异构酶C丙酮酸激酶的三级结构D蛋白质的亚基组成蛋白质的多条肽链在天然构象空间上的排列方式，多以弱键互相连接，如疏水力、氢键、盐键。每条肽链本身具有一定的三级结构，就是蛋白质分子的亚基。亚基四级结构(quaternarysturcture)由亚基组成的亚聚蛋白结构血红蛋白的四级结构亚基的立体排布蛋白质的各级结构维持蛋白质三维结构的作用力盐键又称盐桥或离子键（ionicbond):正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。氢键(hydrogenbond):多肽主链上的羰基氧和酰胺氢之间、侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。疏水作用（hydrophobicinteraction):介质中球状蛋白质的折叠总是倾向与把疏水残基埋藏在分子的内部，在稳定蛋白质的三维结构方面占有突出地位。范德华力(vanderwaalsforce）：指分子间的作用力。广义上的范德华力包括3种较弱的作用力：定向效应，诱导效应，分散效应。二硫键（disulfidebond）绝大多数情况下二硫键是在多肽链的β－转角附近形成的维持蛋白质三维结构的作用力①盐键②氢键③疏水作用④范德华力⑤二硫键蛋白质结构与功能的关系蛋白质必须具备特定的结构，才能表现特定的功能，在蛋白质肽链中有一些基团对特定功能是必需基团，另一些是非必需基团。中心法则：蛋白质的结构是由蛋白质的氨基酸序列所规定—既顺序规定构象同源蛋白质（homologousprotein）：在不同的有机体中实现同一功能的蛋白质，但氨基酸序列存在种属的差异性，如猪、牛和人等胰岛素具有同样的降低血糖的功能，都由A和B链构成，分子量几乎一样，但它们的氨基酸序列存在个别的差异。MammalianTOLL-likereceptors蛋白质工程研究的核心内容蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测创造和改造蛋白质——新蛋白质蛋白质结构分析收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础（结构生物信息学）。X-射线衍射---三维空间结构的测定是验证蛋白质设计的必需手段和基础。需要分离出足够量的纯蛋白质（几毫克～几十毫克）蛋白质的晶体状态与自然状态也不尽相同•核磁共振技术可以分析液态下的肽链结构，绕过了结晶、X－射线衍射成像分析等难点，直接分析自然状态下的蛋白质的结构。现代核磁共振技术已经从一维发展到三维，在计算机的辅助下，可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理。X-raycrystallographicELECTRONDENSITYMAP结构、功能的设计和预测根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能；反之也可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组等实验可以直接考察分析结构与功能之间的关系；也可以通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。创造和改造蛋白质物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等；生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等。基因重组技术：不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质。蛋白质工程的研究策略蛋白质工程基因氨基酸多肽链蛋白质三维结构DNA合成分子设计预期功能转录、翻译DNA合成生物学功能生物学主流反向生物学蛋白质工程设计目标的选择结构设计：目前研究重点和难点，侧重从结构设计出发，从蛋白质的二级结构开始，以摸索蛋白质结构的稳定性。在超二级结构和三级结构设计中，通常选择一些蛋白质结构比较稳定的蛋白质作为设计目标，如固氮酶钼铁蛋白结构和四螺旋束结构。功能设计：主要进行天然蛋白质功能的模拟，如哺乳动物铁蛋白铁氧化酶活性中心的模拟和固氮酶钼铁蛋白活性中心模拟和合成等。分离纯化目标蛋白质改变现有蛋白质的结构的步骤蛋白质的一级结构蛋白质的三维结构及结构与功能的关系根据蛋一级结构设计引物、克隆目的基因根据三维结构和结构与功能的关系及蛋白质改造的目的设计改造方案对目的基因定点突变改造后的基因在宿主细胞中表达分离纯化表达的蛋白质分析分析分析功能和评价是否达到设计目的改变蛋白质结构的核心技术——基因的人工定点突变M13载体法人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物将待研究的基因插入载体M13，制得单链模板，合成相应的互补链，用T4连接酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。经此扩增出来的基因有1/2是突变了的基因，经一定的筛选便可获得突变基因。重组PCR定点诱变法利用两个互补的带有突变碱基的内侧引物及两个外侧引物，先进行两次PCR扩增，获得两条彼此重叠的DNA片段。两条片段由于具有重叠区，因此在体外变性和复性后可形成两种不同的异源双链DNA分子，其中一种带有３’凹险末端的DNA可通过Taq酶延伸而形成带有突变位点的全长基因。该基因再利用两个外侧引物进行第三次PCR扩增，便可获得人工定点突变的基因。大引物诱变法：利用一个带突变位点的内侧引物与一个外侧引物先进行PCR扩增，再以扩增产物作为引物与另一个外侧引物进行第二次PCR扩增而获得人工定点突变的全长基因。PCR多次循环PCRPCRPCR3’5’5’3’3’5’3’5’大引物盒式突变1985年Wells提出一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。一次处理就可以得到多种突变型基因。硫代负链法核苷酸间磷酸基的氧被硫替代后修饰物（α－（S）－dCTP）对某些内切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成负链，然后用内切酶处理，结果仅在正链上产生“缺口”，用核苷酸外切酶III从3｀→5｀扩大缺口并超过负链上错配的核苷酸，在聚合酶作用下修复正链，就可以得到二条链均为突变型的基因。思考题1简单叙述蛋白质蛋白质工程的概念和应用2简述蛋白质结构的基本组件3简单描述蛋白质工程的核心内容4简述人工定点突变的方法