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1实验题目：探究CAPE（咖啡酸苯乙酯）对结肠癌多药耐药性的逆转作用实验背景：结直肠癌（Colorectalcancer,CRC）是人类高发的恶性肿瘤，全球结肠癌的发病率一直居高不下，截止至2011年的统计数据显示，美围CRC每年死亡人数占总死亡人数的9.9%，仅次于肺癌，位于第二位[1]。在我国，截止2005年，结直肠癌发病数和死亡数分别达17.2万和9.9万[2]，死亡率也一直处在比较高的水平，所以说结肠癌一直是很严峻的问题。CAPE是近几年来研究的抗肿瘤药物，是蜂胶的主要提取物之一。国内外研究表明，蜂胶中的CAPE对黑素瘤、结肠癌和胃癌细胞系的作用极为强烈，表现出抑制癌细胞的特性。[3]有研究显示，CAPE可诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡，其作用机制可能与CAPE抑FAK—ERK信号转导通路的激活有关[4]，同时，其他研究的结果显示CAPE可以降低JNK—paxillin信号通路的活性，从而在体外抑制人肠癌细胞HT-29的生长[5]。这些研究目的多在于针对CAPE抑制基因复制或其产物表达的过程，并没有对于CAPE是否能够逆转结肠癌的多药耐药性进行研究，所以我们的课题目的在于探究CAPE能否逆转这种多药耐药性。实验目的及意义1.研究CAPE对于结肠癌的多药耐药性有无逆转作用，探讨CAPE对结肠癌的化疗效果。2.该实验针对于当下热点——恶性肿瘤的研究，从CAPE的抗肿瘤作用，从其对多药耐药新逆转作用方面创新思维，培养创新能力。3.针对肿瘤的发生机制，多药耐药性的发生基础，从而针对性的进行研究。4.针对结肠癌的现状，进行有意义的实验，以确定CAPE的临床应用价值。实验原理：此次试验分为两个定量的测定部分，分别为测定5-FU与维拉帕米（VER）和CAPE合用时的的FR值和给药前后肿瘤细胞分泌的P-gp含量，下面为试验中的相关概念、重要信息及必要原理。多药耐药性多药耐药（MDR）系指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药性的同时，对其他多种结构不同、作用靶位不同的抗肿瘤药物也有耐药性。随着肿瘤化疗药物的广泛应用，肿瘤的耐药性问题越来越突出，已成为肿瘤有效治疗的主要障碍之一。在多药耐药性发生过程中，肿瘤细胞高表达的是P-糖蛋白（P－gp），此种糖蛋白能够将抗肿瘤药物逆浓度从细胞内泵出到细胞外，降低细胞内药物浓度而导致肿瘤耐药[6]。这种糖蛋白是由1281个氨基酸组成的两个完全相同的单体构成，每个单体均有6个跨膜区和1个三磷酸腺苷（ATP）结合点[6]。跨膜区作为膜通道有利于药物转运，而ATP结合点与能量供应有关。大量研究证明，P－gp高表达伴随肿瘤患者预后不良，如低缓解率、高复发率、化疗疗效差、生存期短，可作为肿瘤患者预后的评价指标。Hamilton等[7]首次发现维拉帕米、环孢菌素A(CsA)能与化疗药物竞争性结合P-gp，可以2逆转大肠癌MDR。但其心肾毒性及免疫抑制作用明显，限制了临床应用。P-gp[8]1976年，Juliano[9]等在中国仓鼠卵巢癌细胞中，发现了一种与MDR成正相关的高分子糖蛋白，命名为P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）．P-gp由定位于7，q21.1mdr1（multidrugresistance1）基因编码，属于ABC（APT-bindingcassette）簇转运因子，是一种跨膜糖蛋白，由1280个氨基酸组成，整个分子由完全相同的2个单体构成，每个单体具有6个跨膜区和1个ATP结合位点，跨膜区作为膜通道有利于物质转运，ATP结合位点与能量供应有关[10]．P-gp定位于胞质膜，在人体正常组织中广泛表达[11]，如胃肠道、肝、肾的上皮细胞，脑、睾丸、卵巢、肾上腺的毛细血管。推测其可能与细胞的物质转运和解毒有关，是物种进化过程中抵御有害因素的基础。当正常细胞演变成恶性细胞时，仍继续表达mdr1基因，因此临床上来源于这些组织的肿瘤，对初始化疗就具有耐药性，此为天然性耐药。已证实大约30％的AML患者在初诊时就有P-gp的表达，而大于50％的AML复发患者有P-gp表达[12]。P-gp的检测方法（综合运用免疫学定量检测方法）[13]WesternblotP-糖蛋白经电泳分离后转移到硝酸纤维薄膜上，用抗P-gp单克隆抗体作为一抗（鼠抗人P-gp），酶标二抗（抗小鼠IgG）进行免疫印迹反应，与底物显色，常用化学发光ECL底物和DAB底物，化学发光底物灵敏度大大高于显色底物，较常用。同时，可以用酶标仪测OD450nm值，用标准系列的OD值为纵坐标，标准系列稀释度为横坐标作标准曲线，求出检验标本的浓度。此方法利用特异性抗体鉴定蛋白质，排除了其它蛋白质的干扰，可同时检测内参半定量蛋白含量，是目前国内外常用的检测蛋白方法。本实验中，测定P-gp含量时：实验组为添加CAPE前后的P-gp含量测定；阳性对照为添加VER前后的P-gp含量；空白对照组为添加等量溶剂前后P-gp含量。MTT还原法测定细胞毒性四氮唑[MTT，3-(4，5-dimethylibiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲臜(formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚砜(DMSO)溶解甲臜后，溶液呈紫（红）色，在一定波长（490nm）下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。测出细胞的存活率，对于CAPE以及5-FU的抗癌效果评价有一定的意义，同时对于测定IC50的数值有重要意义。IC50IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度，既“半数抑制浓度”，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度，IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导凋亡能力越强，该数值越低。当然，也可以反向说明某种细胞（本实验为结肠癌细胞）对药物的耐受3程度，IC50值越大，说明肿瘤细胞的耐药性越强，本实验中，用来比较CAPE和VER的对肿瘤细胞耐药逆转效果。肿瘤细胞生长的抑制率肿瘤细胞生长抑制率%＝(1—OD实验/OD对照)×100%以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出样品的半数杀伤浓度IC50。CAPE的逆转作用评价标准（FR）评价逆转效果用逆转倍数(foldreversal,FR)表示：FR=IC50(不加逆转剂)/IC50(加逆转剂)。在本次试验中，阳性对照逆转剂为VER，实验组逆转剂为CAPE。测定逆转倍数时，以VER的逆转作用作为阳性对照组，不添加逆转剂（既FR为1）为阴性对照组。对照组的设计本次试验分为两部分，分别有不同的对照组：第一，空白对照既对该组感染肿瘤的实验组细胞不给与任何药物治疗，在实验前后形成空白对照，以作为肿瘤发展的参考指标；在FR测定的过程中，空白对照组增加到4组，分别是溶剂+5-HU，溶剂+CAPE、溶剂+VER时以及不加入任何的试剂，然后测定OD值，避免实验中由于药物性质出现的误差。第二，5-氟脲嘧啶（5-FU）对照现在的结肠癌治疗过程中，多使用5-氟脲嘧啶对患者进行化疗治疗，我们使用5-HU作为对照组的意义在FR的测定实验中，作为化疗药物来确定IC50的数值。第三，维拉帕米（VER）对照维拉帕米是现下已确定具有逆转肿瘤的多药耐药性的药物。其逆转作用比较强大，并且在较多的药理实验和临床实践中均表明了逆转的优点，以及与抗肿瘤药物共同给药的治疗效果[]。本次试验中，测定VER和CAPE的不同效果，以确定CAPE的抗癌性质。实验材料与方法实验材料：细胞及主要试剂、仪器：人结肠癌氟尿嘧啶耐药株、CAPE试剂、维拉帕米、5-FU、抗P-gp抗体成套免疫组化试剂盒、酶标仪、P-gp标准系列浓度梯度溶液、MTT、DMSO、DAB显色试剂盒、高精度移液器实验方法及内容：1.细胞培养2.结肠癌细胞耐药性的测定采用MTT细胞毒实验方法：取计数生长期细胞接种于96孔板，过夜。4阳性对照组每孔加人不同浓度的5-Fu(10～l05nmol/L)与VER10μg/ml各10μl；实验组每孔加入不同浓度的5-Fu(10～l05nmol/L)与CAPE10μg/ml[4]各10μl；空白对照组加入不同浓度的5-Fu(10～l05nmol/L)和溶剂10μg/ml各10μl，单用CAPE10μg/ml和溶剂各10μl，单用VER10μg/ml[]和溶剂各10μl以及不加入任何药物既加入溶剂20μl。培养3天，加5mg/ml的MTT20μl培养4h。加二甲基亚砜150μl，振荡，酶标仪490nm处测吸光度A490值，测定不同5-HU浓度时的A490值。以OD值纵坐标，以加入的剂量为横坐标作出剂量曲线，然后计算出IC50的值。记录数据到表格1中。计算癌细胞的存活率：癌细胞存活率（%）=(实验孔A490值/空白对照孔④A490值)×100%。进一步通过OD值并计算出CAPE和VER的FR值。3.免疫细胞化学染色法测定癌细胞P-gp的表达：取对数生长期细胞铺片，用空白对照（只添加等量溶剂，排除无关因素的影响），单用5-FU(102nmol/l)+等量溶剂各10μl，5-FU(102nmol/l)+VER(10μg/m1)各10μl，5-FU(102nmol/l)+CAPE（10μg/m1）各10μl为三组实验项目(5-FU采用102nmol/l是因为102nmol/l这样的剂量对肿瘤细胞的抑制作用明显但又不过于强烈[14])。培养3天，冷丙酮固定，山羊血清封闭。滴加鼠抗P-gp单克隆抗体(一抗)，用PBS裱作阴性对照，过夜。顺序滴加生物素化的抗小鼠IgG(二抗)，AB复合物，孵育、振洗。DAB显色，苏木精复染。在OD450nm波长测定P-gp的吸收光度OD值，记录表格2中。作出标准P-gp溶液梯度浓度的吸光度和标准P-gp溶液浓度的标准曲线，求出测定液中P-gp的浓度。数据记录：1.FR测定实验组阳性对照组空白对照组加入物质CAPE+5-HUVER+5-HU等量溶剂+5-HU单用CAPE单用VEROD值5-HUIC50值FR1实验组阳性对照组空白对照组加入试剂浓度5-Fu(10～l05nmol/L)CAPE10μg/ml5-Fu(10～l05nmol/L)VER10μg/ml①5-Fu(10～l05nmol/L)溶剂10μg/ml②单用CAPE10μg/ml和溶剂③单用VER10μg/ml和溶剂④溶剂20μl52.P-pg的测定记录测定物质项目OD值P-pg（μg/ml）实验前实验后实验前实验后CAPEVER空白对照预期结果：由于CAP具有强烈的抗肿瘤效果，在肿瘤辅助治疗方面CAPE可通过消耗肿瘤细胞内谷胱甘肽水平、抑制NF-κB活性途径，增强结直肠癌、髓母细胞瘤细胞对辐射治疗的敏感性[15]。敏感性既是指肿瘤的耐药性有所下降，所以，预期实验应该出现阳性结果。参考文献：[1]JenudA,MurrayT．WardE．eIa1．Cancerstafstic82005[J]．CACancerJdin．2005．55(1)：10．[2]唐楠.结肠癌相关基因研究进展[J].医学综述，2012,18（2）：201-209[3]王秀芳.咖啡酸苯乙酯的药理作用及机制研究进展[J].国外医学医学地理分册，2010,31（3）:187-190[4]梁路昌.咖啡酸苯乙酯靶向调控人结肠癌liT-29细胞FAK．ERK信号通路的研究[J].军事医学,2011,35(12):905-908[5]薛文.咖啡酸苯乙酯对结肠癌细胞JNK—paxillin信号通路的影响[J].中国普通外科杂志,2012,21(4):432-435[6]陈皇，张俞.大肠癌多药耐药机制及其逆转的研究进展[J].西部医学,2010.22(1):163-165[7]HamiltonG，CosentiniEP，TelekyB，etal．Themultidrug-re-sistancemodifiersverapamil，cycl