菌种操作规程

菌种操作规程（MasterOperationProcedureforARAProductionStrain）CA/WA001—2004版1目的建立菌种操作规程，确保菌种保藏、自然选育、生产供种操作规范性，提供优质高产的生产菌种。2范围生产一部菌种组。3责任菌种组操作人员负责本操作规程的实施。安瓿管的制备空白安瓿管的制备安瓿管有三种：手榴弹形、球形、直形。任意选取一种放于重铬酸钾-浓硫酸溶液（100g/mL）中浸泡10h，然后取出用自来水反复冲洗多次，最后用蒸馏水洗二次，烘干。将写有菌种编号及制备膜的标签放入安瓿管内，将有字的一面向管壁，塞上棉塞，121℃灭菌1小时。脱脂牛奶的制备将买来的新鲜牛奶倒入离心管中以3000转/分离心15分钟，去掉上层的脂，下层即为脱脂牛奶。脱脂好的牛奶倒入试管（Φ18×200mm）或250mL三角瓶中，置消毒锅中灭菌，灭菌温度110℃、时间20分钟。按10%的抽样率抽取灭菌好的脱脂牛奶作无菌实验，每支肉汤倒入约1mL左右的牛奶。然后置37℃恒温间培养48h观察肉汤变化情况，判定是否染菌，如无染菌，即可使用。孢子悬浮液的制备将经过摇瓶考察指标符合要求对照的斜面孢子，制成高浓度的孢子悬浮液，用无菌的毛细吸管或注射器将菌液分装于安瓿管底部，每管装0.3～0.5mL预冻及速冻灌装好的安瓿管置2～5℃冰箱预冻1h，然后置-30℃温度下速冻1h后取出，置真空干燥器内。真空干燥将装在安瓿管的真空干燥器接入真空泵上，在-15℃温度下，抽真空6～8h。然后再在室温抽4h。封口将抽好的安瓿管在酒精喷灯上进行熔封（边抽真空边封口）。安瓿管的泄漏测定用高频火花测定仪进行测定。测定方法：将测定仪照着安瓿管管壁打一枪，如果各壁呈紫色的光即为合格，如果没有颜色，呈白光，即是不合格产品。保藏合格安瓿管置2～5℃冰箱保藏，保藏期为1～10年。记录安瓿管在保藏过程中应控制温度，每天查看温度并填写《温度、湿度原始记录》，在使用过程中应填写《安瓿管使用记录》。砂土管的制备砂的处理普通黄沙用稀酸（1N的HCL或H2SO4）或稀碱（1NNaOH）浸泡12小时后,倒去酸水，用自来水充分冲洗至PH中性，烘干后用磁铁吸去铁屑，经60目筛过筛后备用。土的处理取离地面1公尺以下的黄土，（不含有机质）打碎，加适量水充分搅拌，将上层混浊液倒出静置（下层成块的土弃之）使土沉淀，倒出上层清液后，再加适量水搅拌，沉淀。如此反复洗涤直到PH呈中性。沉淀出来的土烘干，碾碎，经80目筛过滤后备用砂土管的制备方法将处理好的沙和土按2：1(或其它比例)混合均匀，分装于10mm×100mm硬质玻璃试管中，每支砂土管装量为1.5克，用新做的棉塞塞好，并外包牛皮纸，123～125℃湿热灭菌30min，间歇灭菌6次，每隔24小时一次，最后一次消好后置135～145℃烘箱干烘一小时，然后进行抽样无菌检查，每10支砂管抽1支，将沙土倒入肉汤培养基中，36～38℃培养48小时，若仍有杂菌，则需要全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。砂土孢子的制备斜面孢子的选择及质量标准取经选育的单菌落制备的大试管斜面孢子或生产良好的茄氏瓶斜面孢子，具以下条件：孢子层生长丰满，较均匀，孢子数量较多，少水，孢子呈淡黄色。斜面孢子一般培养7～9天，孢子成熟。经无菌试验检查正常。发酵摇瓶试验生产能力符合要求。生产能力试验：原则上每批斜面孢子应作生产能力试验，尤其在大生产不正常情况下，为配合发酵工艺寻找异常原因，每批斜面应作摇瓶考察。7-9天11天斜面孢子摇瓶发酵放瓶指标要求：DW≥（对照）94%；TL≥（对照）94%；AA≥45%，指标符合要求，方可使用，并填写《摇瓶考察配制记录》和《原材料摇瓶考察》。生产斜面的制备生产斜面分为子斜面和母斜面，其PDA培养基配方如下：成分马铃薯葡萄糖琼脂KH2PO4MgSO4配比20%2%2%0.05%0.025%规格自然分析纯生物试剂分析纯分析纯生产斜面选择无芽马铃薯去皮后用蒸馏水洗干净，称量所需重量，并切成边长0.5厘米左右的方形。将马铃薯碎块放在铝锅内，加入一定量的蒸馏水，置于电炉上煮沸30分钟，边煮边搅拌，防止马铃薯结底。用双层纱布滤出马铃薯原液，然后按照配方将称量好的葡萄糖加入溶解，再用吸管吸取KH2PO4、MgSO4溶液加入，用量筒定容至所需体积，PH自然。将定容后的培养液放置电炉上加热，将称量好的琼脂，边搅拌边加入，待琼脂全部融化后，取下培养基进行分装。母斜面用30×200mm的大试管分装，每支大试管约20mL；子斜面用茄子瓶分装，每支约60mL，装好后，塞好棉塞，用双层纱布扎口后，再用牛皮纸扎口，放置在不锈钢筐中，盖上牛皮纸，准备消毒。将准备好的不锈钢筐放在消毒车上推入消毒柜内，按蒸汽消毒柜使用方法用蒸汽消毒，119～121℃，保温30分钟，接种用具保温60分钟。消毒结束后，取出斜面待温度降至40～50℃时，将大试管或茄子瓶摆成斜面，空白斜面培养1～2天，观察无杂菌生长后，包装好备用，并填写《PDA斜面配制记录》和《培养基接种用具消毒记录》。母斜面接种及培养母斜面接种由两人操作，一人为主操作安瓿管，一人为辅操作大试管。首先用消毒好的砂轮在安瓿管上端1/4处划痕，用纱布包住，掰开上端。用毛细吸管吸取0.5mL左右的无菌蒸馏水加入安瓿管中，搅拌均匀，然后吸取0.1～0.2mL接入大试管斜面中，每支安瓿管接3支大试管。用无菌铲将种液在斜面上划线，使之均匀分布，然后塞上棉塞，用双层纱布扎口，并将接种铲在肉汤培养基中蘸一下做无菌试验，将肉汤放置37℃培养间培养。将接种后的母斜面放置培养间，温度28℃，湿度50～70%，培养7～9天，观察生长情况，并填写《母斜面生长记录》和《温度湿度原始记录》。母斜面生长成熟后，取下，无菌试验正常则用0.1%新洁而灭溶液灭菌后再用牛皮纸扎口后放置冰箱低温保藏备用温度2～8℃，保藏期不超过15天；无菌试验不正常则按废样液处理办法处理并填写《废样液处理记录》。子斜面接种及培养子斜面接种由两人操作，一人为主操作，一人为辅操作。首先将子斜面和母斜面的双层纱布解去，将绳子和纱布放在超净台左边待用。主操作将母斜面和子斜面的棉塞逐个打开，并在酒精灯火焰上烧瓶口至无水雾为止。主操作用无菌铲将母斜面上的孢子和菌丝刮下，接种于子斜面中，利用子斜面的冷凝水，将孢子和菌丝打散，均匀涂布于子斜面表面，然后塞上棉塞，用双层纱布扎口，并将接种铲在肉汤培养基中蘸一下做无菌试验，将肉汤放置36～38℃培养间培养。一支母斜面接种一般接1～2支子斜面。将接种后的子斜面放置培养间，温度28℃，湿度50～70%，培养7～9天，观察生长情况，并填写《子斜面生长记录》和《温度湿度原始记录》。子斜面生长成熟后，取下，无菌试验正常则用0.1%新洁而灭溶液灭菌后再用牛皮纸扎口后放置冰箱低温保藏备用，保藏期不超过15天；无菌试验不正常则按废样液处理办法处理并填写《废样液处理记录》。母瓶菌丝的制备母瓶培养基配方成份葡萄糖酵母粉PH配比3%1.5%8.2～8.8规格分析纯符合酵母粉验收标准配制称量时，一般将不溶或难溶物质（如酵母粉等）和易溶解物分开称，根据母瓶培养基配方称取所需葡萄糖和酵母粉重量，葡萄糖用蒸馏水溶解，酵母粉直接按配比分装于三角瓶内。定容后用10N的NaOH调节PH至8.2～8.8，按每瓶100mL的量分装于500mL直口三角瓶内，塞好棉塞，用双层纱布扎口后，再用牛皮纸扎口，放置在不锈钢筐中，盖上牛皮纸，准备消毒。将准备好的不锈钢筐放在消毒车上推入消毒柜内，按蒸汽消毒柜使用方法用蒸汽消毒，119～121℃，保温30分钟，接种用具保温60分钟并填写《母瓶配制记录》和《培养基接种用具消毒记录》。母瓶接种及培养母瓶接种由两人操作，一人为主操作子斜面，一人为辅操作母瓶，主操作用接种铲取孢子于茄氏瓶中，一支铲子只能用于一只子斜面，将3～5支子斜面的孢子接入装有80mL无菌水的带玻璃珠三角瓶中，放置摇床上180～220转/分钟摇10～15分钟制成孢悬液。用10mL吸管吸取5mL孢悬液接种于母瓶，接种后塞上棉塞，包扎纱布，置180～220转/分摇床上，28±1℃培养44～50小时左右，待菌丝长好后取下，准备并瓶。并瓶前应按5%的比例对母瓶进行抽查，观察菌丝的外观，测定菌浓和PH，并进行镜检，合格后才可并瓶。母瓶进罐前，要在无菌条件下并瓶，一般情况下10～12瓶合并为一个种瓶，约1000～200mL。种瓶并好后，将瓶口包扎纱布和牛皮纸，等待进罐，若母瓶不进罐，并瓶后应置于2～8℃冰箱保存，期限不超过2天。并瓶后，每五个三角瓶残液并为一瓶，接种于肉汤培养基中做无菌试验；在接种小罐后将种瓶中的残液接种于肉汤培养基中做无菌试验，将肉汤培养基放置36～38℃培养间培养，观察变化情况，作为一种无菌监测，为事后分析作准备。在发酵水平出现连续异常时，应对母瓶摇瓶进行跟踪实验。母瓶菌丝质量标准外观浅黄色至棕黄色、刺球状或花状。菌浓不小于25%。菌丝阶段Ⅱ～Ⅲ阶段。PH5.5～7.0。镜检没有污染杂菌。小罐接种操作本工艺采用菌丝进罐和倾倒式接种法。接到消毒人员通知后接种。首先准备好无菌石棉手套、白工作服和帽，再准备好工业酒精、火焰圈和打火机。接种人员穿好衣服后，一人将浸泡工业酒精的火焰圈套在小罐接种口上，一人拆开种瓶包扎的牛皮纸和纱布，待消毒人员通知后点燃火焰圈，燃烧一分钟左右，当接种帽旋下后，在火焰圈内迅速打开种瓶棉塞，将种液倾倒入小罐内，残余种液在超净台接种肉汤培养基，作无菌监测，接种完毕后填写《种瓶生产进罐记录》和《培养基接种用具消毒记录》。摇瓶试验发酵摇瓶配方发酵摇瓶配制发酵摇瓶接种操作发酵摇瓶配方成分葡萄糖酵母粉PH配比8%2%8.2～8.8规格符合验收标准符合验收标准发酵摇瓶配制称量时，一般将不溶或难溶物质（如酵母粉等）和易溶解物分开称，根据发酵摇瓶培养基配方称取所需葡萄糖和酵母粉重量，葡萄糖用自来水溶解，酵母粉直接按配比分装于三角瓶内。定容后用10N的NaOH调节PH至8.2～8.8，按每瓶100mL的量分装于500mL翻口三角瓶内，塞好专用夹心纱布，用牛皮纸扎口，放置在不锈钢筐中，盖上牛皮纸，准备消毒。将准备好的不锈钢筐放在消毒车上推入消毒柜内，按蒸汽消毒柜使用方法用蒸汽消毒，119～121℃，保温30分钟，接种用具保温60分钟并填写《摇瓶配制记录》和《培养基接种用具消毒记录》。发酵摇瓶接种操作发酵摇瓶接种由两人操作，一人为主操作子斜面，一人为辅操作摇瓶，主操作用接种铲取孢子于茄氏瓶中，一支铲子只能用于一只子斜面，将3～5支子斜面的孢子接入装有80mL无菌水的带玻璃珠三角瓶中，放置摇床上摇10～15分钟制成接种后将摇瓶瓶口纱布扯平扎紧，置180～220转/分摇床上，28℃±1℃湿度50%～70%的条件培养11天后，下摇瓶测生物量、总油和AA的含量并填写《原材料摇瓶考察结果记录》。菌种选育和复壮自然分离初筛、复筛自然分离每年进行一次。先将菌株作分离培养，挑出若干个单孢子菌落，将这些菌落初筛和复试，选出比出发菌株高产的优良菌株孢子悬浮液制备：取斜面孢子于适量的有玻璃珠的无菌水的三角瓶中，放置小摇床上，时间一般为15分钟即可。分离培养基为马铃薯培养基（PDA）。在灭菌好的培养皿内，加入约15mL灭菌好的马铃薯培养基，置水平凝固后，一支1mL无菌吸管从孢子悬浮液中吸取1mL注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混和，然后用一支1mL无菌吸管从此试管中吸取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5各种稀释度的孢子悬浮液（注：稀释液最好提前准备，空白培养1～2天为好）。将上述各种稀释度的溶液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的顺序，用无菌的涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。将其放于28℃±1℃，温度50%～70%的恒温间培养48小时左右，待菌落长好后挑出若干