第六章动物实验的基本方法

第六章动物实验的基本技术方法一.动物实验前的准备动物实验前的理论准备:实验动物方面的基础知识;选题;方案的制订;方法的选定动物实验前的条件准备:实验仪器、药品、试剂、实验动物预备实验二动物实验的设计与分组1.设计原则：对照性原则：设对照组，应有可比性，分为自体对照和组间对照一致性原则：对照组和试验组除处理因素外，其他因素保持一致重复性原则同一处理要设多个样本例数，为估计试验误差、降低试验误差、增强代表性，提高实验结果的精确度随机性原则：随机分组客观性原则实验设计、选择观察指标以及结果判断要客观2.差异的控制：差异的来源：⑴实验者；⑵动物；⑶动物与环境的相互作用实验者带来的差异实验过程的实施：不准确的测量动物固有的差异动物来源不一饲养管理的差别动物生活环境不同动物健康状况动物与环境相互作用引起的差异群居因素，每个笼盒饲养动物数量动物与实验操作过程之间的相互作用引起饲养操作与实验操作的顺序实验操作引发的动物之间的影响三.实验动物的领取明确实验所用动物的品种、品系、规格、等级、以及实验的大致时间表填写动物申领计划表，教研室主任签字生效填写动物领用表,确定所领动物的品种、品系、规格、数量四.实验动物的抓取和固定小鼠的抓取和固定抓取方法图6—1小鼠抓取固定方法:徒手固定;固定板固定;固定架固定;简易固定图小鼠保定大鼠的抓取与固定抓取方法固定方法:徒手固定;固定板固定;卵圆钳固定•豚鼠的抓取与固定抓取方法固定方法徒手固定固定板固定图豚鼠抓取和保定•家兔的抓取与固定抓取方法固定方法徒手固定;盒式固定;台式固定图兔抓取和保定•犬的抓取与固定抓取方法固定方法慢性试验中犬的固定方法急性试验中犬的固定方法:头部的固定;四肢固定图狗嘴捆绑保定的方法•猪的抓取与固定抓取方法固定方法猴的抓取和固定抓取方法固定方法五.动物的编号、标记及去毛方法•动物的编号与标记：常用的标记液：①3%~5%苦味酸溶液（黄色）②0.5%中性红或碱性品红溶液（红色）③2%硝酸银溶液（咖啡色，涂后需光照10分钟）④煤焦油酒精溶液（黑色）图个体染色标记法编号原则：先左后右，从前到后。左前肢记为1号，左侧腹部为2号，左后肢3号，头顶部为4号，腰背部5号，尾基部6号，右前肢7号，右侧腹部8号，右后肢9号。编号超过10时，可使用两种不同颜色的溶液，把一种颜色作为个位数，另一种为十位数。六.实验动物被毛的去除方法1.剪毛法2.拔毛法3.剃毛法4.脱毛法常用的化学药品：硫化钡（BaS）、硫化钠（NaS）、硫化钙（CaS）七.动物的麻醉方法常用的麻醉剂1.挥发性麻醉剂:乙醚、氯仿等2.非挥发性麻醉剂：苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、硫喷妥钠等巴比妥类的衍生物，盐酸氯胺酮、水合氯醛等3.中药麻醉剂：洋金花、东莨菪碱等其他麻醉辅助用试剂：•镇痛剂：芬太尼、埃托菲等•镇静剂：氟阿尼酮、乙酚丙嗪等•抗胆碱药：阿托品、格隆溴铵等•肌松剂：筒箭毒碱、泮库溴铵等•其它：α-2激动剂——美托咪定，对狗、猫、兔及大多数啮齿类动物可产生良好的镇静和镇痛效果动物的麻醉方法1．全身麻醉①吸入法:②腹腔和静脉给药麻醉法2.局部麻醉:盐酸普鲁卡因、盐酸可卡因、利多卡因麻醉注意事项:①静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张性、角膜反射和对皮肤夹捏的反应，当这些活动明显减弱或消失时，停止注射。②麻醉时要注意保温。保温方法有：实验桌内装灯，电褥，台灯照射等③作慢性实验时，在寒冷季节，麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平。④注意保持动物的呼吸道的通畅，麻醉前禁食.八.动物的给药途径和方法实验动物的给药方法主要分为注射法和投入法两种，注射法又分为：皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、脑膜下注射、脑内注射、胸腔内注射、腰椎内注射、静脉注射、关节腔注射和心内注射等方法，投入法可分为：鼻腔内投入、胃腔内投入、肠管内投入、气管内投入以及经口腔投入。•小鼠的给药途径和方法灌胃（i.g）:动物要固定好；头颈部保持平展；要沿着口角进针，再顺着食管方向插入胃内；决不可进针不顺就硬向里插。皮下注射（s.c）:常选用颈背部皮肤。图大小鼠的灌胃皮内注射（i.d）:观察皮肤血管的通透性变化及观察皮内反应，多用于接种、致敏实验等。雄性较雌性皮肤紧密，注射难度大。肌肉注射（i.m）：较少应用腹腔注射（i.p）:静脉注射（i.v）：一般采用尾静脉注射。小鼠尾部背腹各有一根动脉，两侧各有一根静脉。图小鼠腹腔注射图小鼠尾静脉注射•大鼠的给药途径和方法灌胃:左手按徒手固定方式固定大鼠,使大鼠伸开两前肢,手掌握住大鼠背。方法与小鼠相同。皮下注射：常选在左侧下腹部或后腿皮肤处，方法同小鼠。皮内注射：常选用背部脊柱两侧的皮肤，方法同小鼠。肌肉注射：一般选择股二头肌注射，但应避免伤及坐骨神经，否则会导致后肢瘫痪腹腔注射：用左手的大拇指、食指和中指从大鼠的前肢和头部后面抓住大鼠，同时用身体抵住大鼠的两后肢使之固定，使腹部向上并伸展，注射方法与小鼠相同。静脉注射：尾静脉•豚鼠的给药途径和方法经口给药：固体药物的投入液体药物的投入皮下注射：大腿内侧面、背部、肩部等皮下脂肪少的部位皮内注射：脊柱两侧肌肉注射：大腿外侧肌肉腹腔注射静脉注射：耳缘静脉外侧跖静脉•兔的给药途径和方法灌胃：确保灌胃管插入胃内；药液推完后将残留在灌胃管内的药物用水冲入胃内，确保给药剂量的准确皮内注射：背部脊柱两侧的皮肤皮下注射：背部和腿部皮肤肌肉注射腹腔注射静脉注射：耳缘静脉图兔的灌胃图兔的耳静脉注射•犬的给药途径和方法经口给药：液体药物的投入：同兔固体药物的投入皮下注射肌肉注射腹腔注射静脉注射：头静脉、小隐静脉、正中静脉、大隐静脉等图狗的小隐静脉注射•猴的给药途径和方法经口给药：固体药物的投入液体药物的投入皮下注射肌肉注射静脉注射图猴的后肢皮下静脉注射•猪的给药途径和方法灌胃、皮下（耳根）、皮内（耳壳外侧或腹侧）、腹腔注射、静脉注射（耳缘静脉）实验动物用药量的确定及计算方法动物给药量的确定：先用小鼠粗略的探索中毒剂量或致死剂量，然后用小于中毒量的剂量或致死量的若干分之一为应用剂量，一般可取1/10-1/15。植物药粗制剂的剂量多按生药折算化学药品可参考化学结构相似的已知药物，特别是化学结构和作用都相似的药物的剂量。确定剂量后，若第一次实验的作用不明显，动物也没有中毒的表现，可加大剂量再次实验。最好同时用几个剂量做实验。用大动物进行实验时，开始的剂量可用给鼠类剂量的1/15-1/2。确定动物给药剂量时，要考虑动物的年龄大小和体质强弱确定动物给药剂量时，也要考虑因给药途径的不同，所用剂量也不同。实验动物用药量的计算方法一般按mg/kg体重或g/kg体重计算，应用时须从已知药液的浓度换算出相当于每kg体重应注射的药液量（ml数），以便给药人与动物及各类动物间药物剂量的换算方法人与动物用药量的换算：动物对药物的耐受性比人大，一般可按此比例：人用药量为1，小鼠、大鼠为25-50，兔、豚鼠为15-20，狗、猫为5-10。也可采用人与动物的体表面积计算法来换算人的体表面积计算法：许文生氏公式体表面积（cm2)=0.0061×身高（cm)+0.0218×体重(kg)-0.1529动物的体表面积计算法：Meeh-Rubner公式W（体重，g）2/3A（体表面积，m2)=K×10000K是常数，大、小鼠为9.1；豚鼠9.8；兔10.1；猫9.8；狗11.2；猴11.8九.动物血液的采集方法(一)大小鼠的血液采集方法眶静脉丛（窦）采血（多次重复）：轻压颈部两侧，眼球充分外突眶动脉和眶静脉取血（大量采血）：尽量使动物眼周围皮肤往眼后压，眼球突出充血，弯头镊迅速夹去眼球尾静脉采血：剪尾或切开尾静脉：将尾巴在热水中浸泡数分钟或用酒精/二甲苯反复擦试针刺尾静脉其它：心脏采血、大血管采血等(二)兔、豚鼠的血液采集方法耳中央动脉采血：兔耳缘静脉采血：兔心脏采血：兔、豚鼠颈动（静）脉采血：背跖静脉采血：豚鼠(三)犬的血液采集方法前后肢皮下浅层静脉采血：颈静脉采血隐动（静）脉采血股动脉采血心脏采血(四)猪的血液采集方法耳大静脉心脏采血(五)猴的血液采集方法前肢头静脉后肢皮下静脉十.动物的安乐死方法一.原则：尽量减少动物的痛苦，避免产生惊恐、挣扎、喊叫注意实验人员的安全方法容易操作不能影响实验结果尽可能缩短致死时间判断是否死亡时不仅要看呼吸，而且要观察神经反射、肌肉松弛等情况二.方法颈椎脱臼法：大、小鼠、豚鼠、兔空气栓塞法：兔、猫、犬放血法：大、小鼠、豚鼠、兔、猫、犬断头法：大、小鼠、沙鼠药物法：药物吸入：大、小鼠、豚鼠等；CO2、CO、乙醚、氯仿等药物注射：兔、犬静脉注射氯化钾、巴比妥类麻醉剂、DDT等病理解剖与取材病理解剖：动物麻醉后固定好，依次打开胸、腹腔，观察脏器形态病理组织学取材：——病理切片、染色及组化用ⅰ：10%甲醛溶液作为固定液ⅱ：取样要有代表性，包括病灶及周围组织ⅲ：组织块大小1-1.5cm，厚度不超过0.2cmⅳ：组织要完整，注意夹捏组织时别弄破，减少人为的组织损伤ⅴ:固定液要淹没组织块，最好每个组织块单瓶固定，瓶体上标注好组别、动物编号、组织名称、组织块数量、取材时间等内容。电镜超薄切片取材：ⅰ：4%戊二醛固定ⅱ：用刀片切成1cm3大小的组织块，避免反复切割组织造成人为损伤，取材要迅速，尽快放入固定液中ⅴ:固定液要淹没组织块，每个组织块单瓶固定，瓶体上标注好组别、动物编号、组织名称、取材时间等内容。动物实验中的饲养管理单性别分笼饲养性别鉴定：生殖孔与肛门之间的距离，雄性比雌性长动物个体标记：染色法各组别笼盒进行标记，按顺序放置饲养密度：注意房间的温湿度、通风换气、光照等环境因素饲养管理：ⅰ：不间断饮食ⅱ：及时更换垫料与笼盒：一般小鼠每周至少更换一次垫料，大鼠一周两次；笼盒与垫料一起更换，并进行清洗与灭菌处理ⅲ：及时添加饲料、更换饮水，饮水原则上整瓶更换，半瓶时倒掉后瓶体清洗灭菌ⅳ：每日至少进入动物房观察1次，饲养操作与观察尽量固定时间ⅴ：房间每周至少清扫一次，最好用消毒药水进行必要的擦洗。ⅵ：更换的垫料及废弃物不得随便丢弃，动物尸体单独包装后送至冷库，集中焚烧处理。论文中有关实验动物和动物实验的描述动物的品种、品系、规格、性别、数量、分组、来源品种、品系名称要写全，不能用缩写；明确所选用动物的年（月、周）龄、体重（平均数±标准差）；性别（单一性别或雌雄各半）；数量（每个实验组几只）；来源（动物供应单位，生产或使用许可证号）如：40只8-10周龄成年健康C57BL/6J小鼠，购自中科院上海实验动物中心（SCXK（沪）2008-1021）。雌雄各半，体重为20.4±1.23g，随机分成4组，每组10只。动物饲养的环境与条件动物自由采食和饮水，小动物（大、小鼠）饲养于屏障系统内，一般要写出屏障系统的主要技术指标，如写成“饲养于温度为21±2℃，湿度为50±5%的屏障系统内”动物实验所用方法如采血、给药以及动物处死的方法等，写法要规范。如灌胃、眶静脉丛采血、颈椎脱臼处死等。