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第五章植物染色体工程植物染色体工程是按照一定的设计有计划消减、添加和代换同种或异种染色体，引发产生各种整倍体变异和非整倍体变异，从而改良植物的遗传基础，培育符合人们需要的新种质或新品种的方法和技术。第一节园艺植物单倍体的制备单倍体（haploid）是指体细胞中含有本物种配子体（gametophyte）染色体数目的个体。制备园艺植物单倍体一般采用离体诱导法从具有单倍染色体数的性器官获得植株。其中，雄配子途径以雄性器官为外植体，经历雄核发育（androgenesis）获得单倍体；而雌配子途径以雌性器官及其相关结构为外植体，经雌核发育（gynogenesis）获得单倍体植株。一、雄配子途径采用花药或花粉培养（或游离小孢子），即离体培养花药和花粉（小孢子），使小孢子改变原来的配子体发育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，从中鉴定出单倍体并加倍成纯合二倍体。离体条件下对植物的花粉或花药进行培养（PollenCultureandAntherCulture）获得单倍体植株的技术最早是在1964年由印度植物学家Guha和Maheshiwari在毛叶曼佗罗（Daturainnoxia)的花药培养中成功获得单倍体植株。目前已在250多种植物中由花药或花粉培养获得单倍体植株。1.花药和花粉（小孢子）培养的基本程序:外植体的选择----预处理----表面灭菌----接种----培养----再生植株-----单倍体鉴定----染色体加倍----获得纯合二倍体。（1）材料的表面灭菌与无菌操作：对花蕾进行表面灭菌，然后分离花药和花粉。（2）花粉的分离与清洗：花药漂浮培养自然释放法：把花药接种在液体培养基上，花药漂浮于液体表面经1-7天的培养，药壁开裂，花粉自然散落下来．及时将花药壁从培养瓶取出，留下的花粉继续培养。机械分离法A.分离：把花药放在玻璃容器中，加入一定量适当浓度的蔗糖溶液，加入适量液体培养基，用注射器内筒轻轻挤压花药把花粉挤出来。或用磁力搅拌器把花药搅裂使花粉散出来。B.过筛：把上述的花药残渣和花粉的混合液经·一定孔径的不锈钢网或尼龙网过滤。花粉滤液注入离心管。C.清洗：花粉药壁混合液置于100-1000转／分的速度下离心1-5分钟，上清液再离心，最后悬浮花粉。密度为104-105/ml。（3）花粉培养方式：直接培养法：不经预处理直接接种于培养基。看护培养法：花药接种于培养基，上面放置一块滤纸，花粉接种于滤纸上。微室培养法:盖玻片上滴加一滴琼脂，花粉接种在琼脂上，反向放置于凹型载玻片上。2.雄核发育在适宜离体培养的条件下，花粉（或小孢子）的发育偏离活体时的正常发育而转向孢子体发育，经胚状体途径或器官发生途径形成完整植株，称为雄核发育。离体小孢子发育途径（雄核发育，Androgenesis）：小孢子第一次分裂为均等分裂（B途径）形成大小相似的细胞，然后由单一类细胞形成多核花粉细胞（途径Ⅰ)。小孢子第一次分裂为不均等分裂(A途径)：根据第二次及以后的分裂不同又分为A-V途径（营养核分裂,途径Ⅱ）、A-G（生殖核分裂，途径Ⅲ）、A-VG（营养和生殖核均分裂，途径Ⅳ）、C（分裂中出现融合加倍等现象）途径等。第一次有丝分裂为均等分裂，B途径.第一次有丝分裂为不均等分裂.A.途径（D.自然萌发）C途径，在第一次不均等分裂后，营养核、生殖核同时核内复制Figure-Segmentationpatternofinvitrowheatpollenobservedfromthe1stto14thdayofantherculture.Thefigureshowsthatauninucleatedmicrosporemaydegeneratebeforedivision,(a)ormaygiverise,bymitosis,tonormalbinucleatedgrainpresentingvegetativeandgenerativenuclei(b).Identicalnucleiareformedinlowfrequency(c).Thefirstmitoticdivisionoccursatthe4thdayofculture.Thenormalbinucleatedpollenmayfollowthenormalinsitudevelopmentalpatternformingstarchandthen,degenerate(d).Thesecondmitoticdivisiontakesplaceatthe6-8thandatthe10thdayofculture.Intheandrogeneticpollen,thevegetative,generativeorbothnucleiareabletodividegivingrisetoanembryo(e,f,g).Inpollenwithidenticalnuclei,bothcellscontributetoandrogenesis(h).Pollendegenerationcanoccurinanystepofthisprocess.Atthe14thday,multicellularstructurescanbeseen(i).花粉植株的诱导：（1）胚状体途径直接形成胚状体。（2）愈伤组织途径形成愈伤组织然后分化出不定芽等器官，最后发育成完整植株。3.影响花药和花粉（小孢子）培养的主要因素（1）供体植株基因型：植物属间、种间、品种间可能存在一定的差异。（2）小孢子发育时期：醋酸洋红染色镜检花粉发育时期。大多数植物以单核后期花粉适宜花药培养。（3）供体植株的生理状态：受植株生长环境和生理年龄等影响。如木本植物幼龄植株比老龄诱导率高；始花期和盛花期比开花末期适宜；一二年生草本生长健壮且处于生殖高峰期的花粉花药诱导率高。四分体:醋酸洋红染色四分体:Alexander’s染色单核期双核期成熟花粉粒不同发育时期的烟草小孢子•对不同发育阶段的花药进行培养测试•确定最佳小孢子发育时期的形态特征•注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的变化而发生变化不同发育阶段的烟草花芽花粉发育时期的确定（4）预处理：花粉和花药培养中材料的预处理方法有黑暗处理、光照处理、高渗处理（蔗糖、甘露醇等）、药物处理（秋水仙素、乙稀利、EMS等）、温度处理以及射线处理（r射线）等。温度处理又包括低温处理和高温处理，接种前的处理和接种后的处理等，采用较多的方式是把取来的材料放在冰箱里3-10℃下进行1-15天的低温处理。也可采用接种后预处理的方法。（5）培养基成分：培养基类型MS、Miller、Nitsh、H、N6、W14等。激素及生长调节剂早期要求生长素促进分裂，后期细胞分裂素促进花粉植株的形成。碳源及其他成分高浓度蔗糖等，要求较低的铵态氮、氨基酸等。（6）温度和光照：前期要求高温（25-28℃），光照条件要求不高，愈伤组织诱导阶段黑暗或弱光、散射光培养；分化阶段光照有利于分化。（7）接种方式和密度接种方向和密度影响小孢子离体形态发生。不结球白菜小孢子培养二、雌配子途径植物胚囊中具有单倍性染色体构成的细胞在适当的条件下可以发育成单倍体植株，这就是制备单倍体的雌配子体途径，常用的方法是通过未授粉子房和未授粉胚珠培养。或采用其他方法通过雌配子体途径获得单倍体。1980年成功培养了未授粉的非洲菊、烟草的胚珠，获得了单倍体植株。显花植物花的结构图示1.未受精子房或胚珠培养的意义是以未受精子房或胚珠为外植体诱导单倍体的方法。1976年SanNoeum首次在大麦未受精子房培养得到单倍体植株，并采用离体雌核发育来阐明单倍体产生的过程。目前已在向日葵、甜菜、黄瓜、洋葱、百合等园艺植物上获得了成功。（1）目前部分植物花粉花药培养技术尚未成功建立或诱导频率过低，因此可以采用未受精子房或胚珠培养；（2）对于雄性不育植物也可以采用该方法培养单倍体；（3）未受精子房或胚珠培养获得的再生植株为绿苗，白化现象少；（4）未授粉子房或胚珠培养再生植株稳定；（5）雌雄异株植物可以采用未授粉子房或胚珠培养获得单倍体。2.雌核发育胚囊中具有单倍性染色体构成的细胞都可以通过离体雌核发育产生单倍体植株，包括（1）助细胞或胚囊的无配子生殖产生单倍体；（2）卵细胞、助细胞和反足细胞发育产生单倍体；（3）非正常发育的大孢子四分体产生单倍体。3.雌核发育的主要影响因素（1）基因型：培养难易程度受基因型影响。（2)供体植株的生理状态：适宜生长条件下的供体植株，其未授粉子房和胚珠培养效果较好；生理年龄小，培养效果好。（3）胚囊发育时期：接近成熟阶段的子房和胚珠易培养成功。（4）培养基成分：A.植物激素授粉胚珠：细胞分裂素对胚发育通常有促进作用。未授粉胚珠：外源激素不利于向日葵孤雌生殖。矮牵牛未授粉胚珠培养不需激素，其他需要适当添加。B.有机物：添加有机附加物可以促进授粉胚珠的发育。C.蔗糖浓度：3-12%，通常5%，高浓度利于孤雌生殖。（5）培养条件：温度以25℃为适宜，黑暗条件有利于雌核发育。（6）接种方向：花柄插入培养效果好。第二节园艺植物多倍体的制备体细胞含有3个或3个以上染色体组的生物体称为多倍体（polyploidy）。多倍体在植物形态和细胞上都表现明显的巨大性、遗传性较丰富，变异的范围广；对外界环境条件的适应性强，抗病力、耐旱力、耐寒力一般比二倍体强，但结实力多会下降。人工诱导多倍体方法较多，如利用未减数配子（2n配子），采用物理方法（机械损伤、射线、温度、高速离心）使染色体加倍；采用原生质体融合、胚乳培养等也可以获得多倍体。采用化学方法诱导植物染色体加倍，常用的是秋水仙素（colchicine），具有阻碍纺锤丝形成和赤道板的产生而导致染色体加倍。此外抗微管形成的除草剂如氟乐灵（trifluralin）、氨磺灵（oryzalin）、APM等也具有染色体加倍功能。A.浸泡法无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，再转移至新鲜培养基中培养。B.生长点处理秋水仙素水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。C.培养基处理将植株的任何一部分作为外植体，接种于附加一定浓度的秋水仙素培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的相同培养基中继续培养诱导胚状体。离体诱导影响因素：（1）外植体：愈伤组织、种子、芽、茎尖分生组织、叶片、原球茎等均可；以生长旺盛时期为适宜。（2）加倍剂的类型：秋水仙素、氨磺灵、氟乐灵等。（3）加倍剂浓度和时间：高浓度短时间或低浓度长时间处理。（4）加倍剂的加入时间：接种前浸泡处理或先获得无菌材料再处理。（5）助剂：如二甲基亚砜（DMSO）。胚乳培养胚乳在被子植物中是双受精的产物，由极核和雄配子结合成的三倍体组织。而裸子植物胚乳在受精前形成，为单倍体。仅40多种植物进行胚乳培养研究，20种获得再生植株，如猕猴桃等。多存在混倍现象。胚乳培养应注意的问题：（1）确定适宜的发育时期（生长旺盛期）；（2）严格区分胚乳和其他组织；（3）合理使用激素；（4）注意光、温条件（24-280C；黑暗条件）。第三节园艺植物非整套染色体操作生物体的核内染色体数不是染色体基数整数倍，而发生个别染色体增减的生物体称为非整倍体（aneuploid）。非整倍体多不具有直接利用价值，但可以利用非整倍体进行染色体添加、消减、代换和易位，将带有异源优良基因的染色体或片段导入生物体中，从而达到定向改变遗传特性，创造新类型和新品种的目的。一、染色体代换系的创制生物体的染色体被异源种属染色体所代换的品系称为代换系，一条染色体被代换称为单体代换系，一对染色体被代换称为二体代换系，整套被代换称为整套染色体代换系。常规法创制代换系采用单体法、缺体回交法和单端体法等。生物技术方法创制代换系主要是组织培养法，其中常用的是花药（花粉）培养法。对远缘杂种的花药（或花粉）进行培养，再生植株中有可能鉴定出染色体代换系。二、染色体附加系的创制将同种或异种的染色体导入受体中，这种染色体在受体中增加的技术叫做染色体附加。具有附加染色体的品种或品系叫附加系。导入一条或几条异源种属的染色体的品