第六章核酶抗体酶模拟酶.

第六章核酶、抗体酶、模拟酶内容核酶脱氧核酶抗体酶模拟酶第一节核酶Ribozyme一、发现80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的ThomasCech和美国耶鲁大学的SidneryAltaman各自独立地发现RNA具有生物催化功能。T.Cech和S.Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。ThomasCechSidneryAltaman原生动物四膜虫的RNA剪切实验RNaseP:催化tRNA前体的5’-端成为成熟的内切核酸酶蛋白质部分RNA部分组成1/43/4为RNA分离后无活性无活性RNA部分在Mg2+存在下，有RNaseP作用。RNA部分用SDS-酚抽提或者蛋白酶作用，都不受影响。体外转录从E.coli的基因在体外转录，得到的产物RNaseP前体，同样能加工tRNA前体RNaseP-RNA前体和RNaseP-蛋白质可以重组成全酶意义RNA型生物催化剂的发现是现代生物学中的一个重大突破功能核苷酸聚合酶的活性，催化肽键的形成，催化甲硫氨酰－tRNA的水解底物除RNA外，还有氨基酸酯、多糖、DNA等。剪切型核酶剪接型核酶根据催化反应锤头核酶I内含子II内含子发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP二、核酶的分类1、剪接型核酶剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子（Intron).剪接型核酶分类I类内含子II类内含子p3’HO-Gp3’pP-GOHpP-G3‘HOⅠ类内含子的剪接机制Mg2+或Mn2+GMP,GDP,GTP外显子内含子或居间序列（Interveningsequence,IVS)5‘UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCUAAAGUAAUCUoH3’5‘GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH3’G-IVSL-19IVS19nt5‘3‘rRNA5‘3‘5‘pGOH3‘5‘3‘四膜虫rRNA前体自我剪接反应Ⅰ类内含子二级结构通式保守序列G结合位点剪接部位引导序列1、转核苷酸作用2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2、水解作用CpCpCpCpCCpCpCpC+pC3、转磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用CpCpCpCpCpCpCpCpCpC+Pi5、限制性内切酶作用CpUpCpUpN+GCpUpCpU+GpNp2‘HO-App-Ap3’OHpP-AHO3’Ⅱ类内含子的剪接机制Mg2+套环的形成5‘3‘外显子连接Ⅱ类内含子有一个保守的二级结构：结构域Ⅰ：两个保守内含子结构序列EBS1,EBS2与两个外显子结构序列IBS1,IBS2互相配对。结构域Ⅴ：高度保守，催化活性必需。结构域Ⅵ：A提供2‘-OHⅡ类内含子二级结构模式5’3’2、剪切型核酶1、自身催化剪切型RNA剪切机制这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。特点：在Mg2+或其他二价金属离子存在下，在特定的位点，自我剪切，产生5‘-OH和2’，3‘-环磷酸二酯末端。锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图三个双螺旋区13个核苷酸残基保守序列剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发生17位（X）的核苷酸残基多数是C,不能是U,G.7位核苷酸残基的置换不会对酶活性产生很大影响锤头二级结构编号7位核苷酸17位核苷酸锤头型核酶对切割位点的识别位点遵守NHH规则（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）。催化过程需要二价金属离子参与。单金属离子催化双金属离子催化发夹（hairpin）结构发现于三种不同植物RNA病毒（烟草环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒）二级结构模型•5个环和4个螺旋形成两个结构域•剪切反应发生在底物识别序列GUC的5‘端2、异体催化剪切型RNA核糖核酸酶P(RNaseP)能剪切所有tRNA前体的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH和5’-磷酸末端。RNaseP由RNA和蛋白质亚基组成。体外：RNA具催化作用,蛋白质作为辅助因子体内：RNA和蛋白质对酶活性都是必需的。•RNaseP可剪切前体5‘端41nt,5’端成熟。•RNaseP所识别的是底物的高级结构。RNaseP底物的二级结构剪切位点三、核酶在医学上的应用1、核酶抗肝炎病毒的研究目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）以及HDV作用的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶。2、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)核酶1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV-Ⅰ基因表达，并率先进入临床Ⅰ期。3、抗肿瘤治疗核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。第二节、脱氧核酶的研究1、体外选择技术筛选脱氧核酶分子•通过优先扩增事先固定在固相载体上的具有自我裂解功能的活性分子来实现的。•通过这一技术已有两种具有RNA裂解活性的脱氧核酶被筛选出来。8-17，10-23。2、脱氧核酶催化特征10-23裂解位点为嘌呤、嘧啶连接双链稳定性越高，酶活性越高对Mg2+,Zn2+,Ca2+,Mn2+有依赖性极强的切割特异性BAA5‘BBABAPCRPCR5‘5‘5‘StreptavidinColumnNaOHcofactor体外选择技术筛选具有自我裂解功能的DNA分子N50(DNA分子库）10-23型脱氧核酶作用机理RYRRNAsubstrate切割点R=AorGY=CorUdeoxyribozyme53手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理茎II(催化部位)茎I(结合部位)5‘3‘3‘CA切割点10203040第三节抗体酶通过生物体免疫系统诱导产生的，具有底物过渡态结合部位的抗体，有很高的催化活性。抗体酶首先是抗体，具有高度选择性，同时又具有酶提高化学反应速度的性质。一、抗原和抗体抗原抗原抗体反应免疫球蛋白IgG的一级结构IgG的三级结构IgG与抗原形成的交联晶格二、抗体酶的原理及发展简述1946年，LinusPauling阐明酶与反应物的过渡态而不是基态发生特异结合。1969年，Jencks提出通过免疫诱导产生抗底物过渡态的抗体，该抗体具有类似酶的催化活性。1975年，Kohler和Milstein发明了单克隆技术，使抗体酶的获得成为可能。三、抗体酶催化的反应：左边是酯诱导反应的半抗原酰胺脱羧分子重排抗体酶的催化特征1、与天然酶相比能催化一些天然酶不能催化的反应有更强的专一性和稳定性2、抗体酶和抗体比较更高的反应特异性反应过程四、抗体酶如何生产？1、拷贝法：优点:可以大量生产单克隆抗体酶缺点:有相当大的盲目性和偶然性，并不能产生新酶。酶第一次免疫抗酶抗体第二次免疫抗体酶拷贝法制备抗体酶2.诱导法关键：用什么样的抗原才能诱导出有特定的酶催化功能的抗体？五、抗体酶的筛选1、ELISA法；筛选对半抗原有亲和力的单克隆抗体2、酶学活性检测法：直接用反应底物检测细胞培养液中抗体的酶活性3、短过渡态类似物法：以过渡态类似物中含有的必需基团的基本结构单元做为筛选单克隆抗体的标准。4、基因筛选法：应用基因探针，对基因抗体库进行分析和筛选。酶联免疫分析•ELISA是将酶作为标记物质，使之和抗原结合形成酶与抗原复合物•然后再根据待测抗体与复合物专一且定量的结合关系，通过测定待测抗体结合的标记酶活力，从而计算出抗原的量酶标免疫分析示意图六、抗体酶的应用前景1、抗体酶在帮助戒毒方面的应用Landry等用可卡因水解的过渡态类似物为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能2.抗体酶用于肿瘤治疗抗体介导前药治疗（ADEPT）技术将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联第四节模拟酶用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在体内的化学反应过程模拟酶的主要研究内容模拟酶的金属辅基模拟过氧化氢酶分子中的铁卟啉辅基催化速率是血红蛋白的一万倍三亚乙基四胺与三价铁离子的络合物模拟酶的活性功能基模拟α-胰凝乳酶的活性中心催化该底物的活性是乙烯基咪唑的63倍模拟酶的高分子作用方式•利用高分子化合物做骨架，引入活性功能基•聚亚乙基亚胺为骨架，引入十二烷基和咪唑基模拟酶与底物的作用模拟酶的性状分类---按照模拟酶的属性主-客体酶模型胶束酶模型肽酶抗体酶分子印迹酶模型半合成酶环糊精模拟酶水解酶模拟转氨酶模拟大环聚醚模拟酶水解酶模拟肽合成酶模拟分子印迹酶制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程分子印迹技术内容选定印迹分子和功能单体，使二者发生互补反应在印迹分子-单体复合物周围发生聚合反应用抽提法从聚合物中除掉印迹分子生物印迹类似于分子印迹，只不过主体分子是生物分子。模拟酶的展望模拟酶的研究近年来进展比较大，但现阶段模似酶无论在催化效率，还是在专一性上都还比较差，要达到实际应用还要有大的技术和理论突破。生物催化剂酶：传统酶、抗体酶――具有催化功能的蛋白质模拟酶：具有催化功能的非蛋白质非RNA非DNA核酶：具有催化功能的RNA或DNA