蔗糖酶的分离提纯

1蔗糖酶的分离提纯【实验目的】1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。【实验原理】蔗糖酶[Ec3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase系统命名：β--D—Fructofuranosideffructonydrolase。蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。它所催化的反应是：HOHOHH蔗糖+HOHOHH葡萄糖果糖蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。在微生物中，酵母中的含量很丰富。在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。我们实验室的研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。【实验材料、仪器和试剂】1．实验材料和试剂(1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母；(4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol／LNaOH；(10)0.5mol／LHCl；(11)0.005mol／L，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol／LNaCl的O.005mol／L，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂CH2OHHOHHHOHCH20HO蔗糖酶22．仪器(1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴；(4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计；(9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表【实验操作】一、葡萄糖浓度标准曲线的制作1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨酸试剂：N0含糖量(mg)O．2％葡萄糖标准液(mL)水(mL)3,5--二硝基水杨酸试剂(mL)OD5401234567891000.40.81.21.62.02.42.83.23.600.20.40.60.81.01.21.41.61.821.81.61.41.21.00.80.60.40.23333333333上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。2．以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。二、蔗糖酶的分离提纯1．蔗糖酶粗品的制备(1)自溶称取10克干酵母，放在200mL的烧杯中，加30mL蒸馏水搅成糊状，再加入1.5克乙酸钠。然后在35℃水浴中搅拌30min，此时会观察到菌体自溶的现象。(2)提取及粗酶的制备往上述自溶液中加60mL蒸馏水，将烧杯用表面皿或玻璃纸盖好，于35℃保温过夜。第二天，将自溶液于4500r／min离心20min。取出离心管，小心将上清液倒入烧杯中，弃沉淀。得到的上清液就是无细胞抽提液，即粗酶液（E1）。量出粗酶液体积，记录。取2mL作为待测活力和蛋白浓度的样品（4℃保存）。2．乙醇分级将粗酶液用稀醋酸调pH至4.5。(1)32％乙醇饱和度按下面的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达32％时所需乙醇体积。X1/（V+X1）=O.323式中X1为所需乙醇体积，V为粗酶液的体积。然后再按X1／0.95换算出使乙醇浓度(按体积)达32％时所需95％乙醇的体积。把粗酶液和量好体积的95％乙醇在冰盐浴中预冷(0～2℃)。小心缓慢滴加乙醇，同时不断搅拌，一定注意不要使乙醇局部过浓，否则会引起酶变性失活。在滴加乙醇过程中，酶液渐渐变混浊，滴加结束后，于3000r／min离心5min。上清转移到另一烧杯中待用，弃去沉淀。(2)47.5％的乙醇饱和度按下式算出使酶液乙醇浓度达47．5％时所需乙醇的量X2/(V+X2)=0.475式中X2为所需乙醇体积，V为粗酶体积。再按X2／0.95算出需95％乙醇的体积。按下式可算出使乙醇浓度达47．5％时所需补加的95％乙醇体积。X2/0.95-X1/0.95=使乙醇浓度达47．5％时需补加的95％乙醇体积按前述方法，继续补加乙醇，使乙醇浓度达47.5％于3000r／min离心3min，弃去上清会得少量沉淀。将沉淀用10mLpH6.0的0.005mol／L磷酸钠缓冲液溶解，并对该液透析过夜或酌情缩短时间，中间换一次透析液。离心，则得到进一步纯化的酶。量出酶液体积，取出2mL，待测活力和蛋白浓度。其他酶液准备上柱。3．DEAE一纤维素柱层析(1)DEAE一纤维素处理在使用前，将市售的DEAE一纤维素按下述方法处理：用去离子水浸泡过夜，用浮选法除去过细部分，留下30min沉积部分，重复几次。然后用0.5mol／LNaOH，水，0.5mol／LHCl，水，0.5mol／LNaOH，水，交替浸泡。其中NaOH浸泡2～4小时，HCl浸泡半小时，每次抽滤后用水洗至中性。最后用0.005mol／L，pH6．0的磷酸钠起始缓冲液平衡。再生方法：用过的DEAE一纤维素可再生重复使用。但要先用0.5mol／LNaOH+0.5mol／LNaCl浸泡后再按常规处理。DEAE一纤维素离子型。水：R--N(CH3)2+H20==eR—N+(CH3)2H·OH-HCI：R—N+(CH3)2HOH-+HCl=R—N+(CH3)2HCl-+H20NaOH：R—N+(CH3)2H·Cl-+NaOH=R—N+(CH3)2H·OH-+Na+(2)装柱本实验使用的层析柱规格为1．8cm(内径)×15cm(高)。把柱子垂直固定好，可用一千锤校正，按柱层析原理部分所述方法，把DEAE一纤维素装柱。床高距柱顶2～3cm为宜。用起始缓冲液洗柱，平衡过夜。注意控制流速，防止柱流干。(3)上样4乙醇分级的酶液，经对起始缓冲液透析，离心后，按层析原理部分所述方法上样。（注意：流速要尽量慢，使目的酶和DE52充分吸附）样品上完后，用起始缓冲液(130mL)洗柱。流出液流出速度为4mL／5min左右。(4)洗脱用含0.15mol／LNaCl的0.005mol／LpH6.0的磷酸钠缓冲液洗脱。洗脱速度4mL／5min。收集20管即可结束。(3～4mL／管)。每隔一管测定活力，确定酶活力峰位置，合并，量出体积。测合并后制剂的活力和蛋白浓度。三、蔗糖酶的活力及蛋白浓度测定1．蔗糖酶活力规定在本实验的条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。2．操作(1)样品的稀释取0.2mL无细胞抽提液(E1)用pH4.6，0.2mol／LNaAc缓冲液稀释40倍；取0.2mL乙醇分级酶液(E2)用上述缓冲液稀释80倍；DEAE--纤维素柱层析酶液(E3)根据情况稀释。(2)反应取两支试管分别加入2mL稀释的酶液。一支做对照，加0.5mL1moL／LNaOH，摇匀，使酶失活；另一支做测定管。然后把两支试管和5％的蔗糖溶液放在35~C水浴中预热恒温。分别取2mL5％的蔗糖加入上述两试管中，并正确计算时间，3min于测定管中加入0.5mL1mol／LNaOH，摇匀，终止反应。从反应混合物中取出0.5mL溶液放入血糖管中，加入3mL3，5一二硝基水杨酸试剂和1.5mL水，摇匀。于沸水浴中煮沸5min后立即用冷水冷却，加蒸馏水稀释到25mL刻度，摇匀，于540nm测光密度。在葡萄糖标准曲线上找到所测光密度对应的葡萄糖含量，然后按下面活力计算公式计算酶活力。3．酶活力计算公式蔗糖酶活力单位：葡萄糖毫克数×9×酶的稀释倍数式中9=4.5/0.5，因酶反应液的总体积是4.5mL，而用3，5一二硝基水杨酸试剂显色时仅取0.5mL。4．蛋白浓度测定E1稀释20倍；E2稀释4倍；E3不稀释。Bradford法测蛋白浓度(见附注1)四、酶纯度鉴定5聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定E1、E2和E3的纯度。具体操作(见附注2)。【结果的处理】样品样品总体积ml总活力蛋白浓度mg/ml总蛋白量mg比活u/mg提纯倍数无细胞抽提液(E1)乙醇分级E2)DEAE一纤维素柱层析(E3)6附实验1Bradford法测定蛋白质含量【实验目的】掌握考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量的原理和方法。【实验原理】在蛋白质的分离、纯化过程中，往往需要有一种快速、灵敏的方法对蛋白质进行定量测定。近年来被广为采用的Bradford法满足了人们的需要。本方法采用考马斯亮蓝G250(Coomassilebrilliantblue，G250，简称CBB—G250)作为染色物质。依其存在形式不同可表现为红色和蓝色，当CBB—G250单独存在时为红色；当其与蛋白质结合后，其颜色变为蓝色。蓝色的深浅与溶液中的蛋白质含量(0～1000µg/mL)成正比，故可用于测定蛋白质含量。该方法快速、重复性好、干扰因素少，CBB—G250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在l小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的于扰。但较高浓度的十二烷基硫酸钠，Tritonx一100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照来消除。【实验仪器与试剂】1．仪器(1)台称(2)721分光光度计(3)容量瓶(4)刻度试管和吸量管2．试剂(1)考马斯亮蓝G250溶液：称取CBB-一G250lOOmg溶于50mL95％的乙醇溶液中，然后加入100mL85％的磷酸，最后加蒸馏水定容至1000mL。(2)标准蛋白质溶液(100μg/mL)：精确称取100mg牛血清白蛋白，用0.9％氯化钠溶液定容至1000mL。(3)生理盐水【实验操作】1．制作标准曲线7取6支试管，按下表操作管试别剂空白12345标准蛋白质溶液(mL)0.20.40.60.81.0生理盐水(mL)1.00.80.60.40.2CBB--G250溶液(mL)5.05.05.05.05.05.0混匀，放置2min，于595nm处比色，记录光密度值(OD值)。以蛋白质含量为横坐标，光密度值(OD值)为纵坐标，绘制标准曲线。2．样品测定取2只试管，按下表操作：管试别剂样品管空白管稀释的未知样品(mL)1.0生理盐水(mL)1．0CBB--C250溶液(ml)5.05．O混匀，放置2min，于595nm处比色，查标准曲线，求得蛋白质含量。注：样品用生理盐水稀释。8附实验2聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定酶的纯度【实验目的】掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法和原理。【实验原理】聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的三维网状结构的高分子聚合物，其网孔大小可由凝胶浓度加以调节。因此用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物时，被分离物质由于所载电荷及其分子大小和形状的差异，在电场作用下以及凝胶网孔的“分子筛”作用下产生不同的移动速度而互相分离。所以此方法具有电荷效应和“分子筛”效应的双重特性。因为这一方法具有设备简单、操作方便、时间短、样品用量少、不易扩散等优点，所以它是鉴定酶和分离蛋白质的有力工具。【实验仪器与试剂】1．仪器(1)SCR型稳流稳压电泳仪(2)垂直板电泳槽及附件(3)10mL注射器、100μL、10μL移液器(4)微量注射器、烧杯、移液管(5)真空泵2．试剂(1)pH8.9Tris-HCl缓冲液（1号）：称取Tris36.6g，lmol／LHCl48mL，TEMED0.23mL，加重蒸馏水定容至100mL。(2)凝胶贮液（2号）：称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸馏水分别溶解，定容至100mL，过滤，棕色瓶4℃贮存可使用2周。(3)0.14%过硫酸铵(3号):称取(NH4)2S2060.14g，加重蒸馏水定容至100mL(现用现配)(4)pH6.7Tris-HCl缓冲液(4号)：称取Tris5.98g，lmol／LHCl48mL，TEMED0.46mL，加重蒸馏水定容至100mL。(5)电极缓冲液(pH8.3)：称取甘氨酸28.8g，Tris6.0g，加重蒸馏水定容至1000mL，pH为8