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第六章细胞工程及其在食品工业中应用生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因一、二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突变性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化。二、建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。生物技术将是未来经济发展的新动力第一次技术革命工业革命解放人的双手第二次技术革命信息技术扩展人的大脑第三次技术革命生物技术改造生命本身主要内容细胞工程的概念细胞融合技术动物细胞工程及应用植物细胞工程及应用微生物细胞工程及应用细胞工程的含义细胞工程是指在细胞水平上的遗传操作，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的技术。第一节细胞融合技术一、细胞融合技术研究进展二、细胞融合技术的涵义三、细胞融合的方法和步骤四、细胞融合技术的应用一、细胞融合技术研究进展Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代出现了电融合技术。生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间苷蓝——青菜大豆——马唐草矮牵牛——龙面花大麦——花生大麦——大豆小麦——矮牵牛油菜——大豆玉米——大豆大豆——野豌豆大麦——蚕豆大豆——草香木犀酵母菌——鸡大豆——烟草大豆——秋水仙人——胡萝卜番茄——马铃薯人——小鼠叶——叶叶——根愈伤组织——叶叶——花瓣种子——种子叶——悬浮细胞叶——花瓣叶——悬浮细胞叶——悬浮细胞悬浮细胞——悬浮细胞叶——根悬浮细胞——叶原生质体——血红细胞悬浮细胞——叶悬浮细胞——叶腹水癌细胞——原生质体叶——根尖纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几种细胞融合成功的例子植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞动物细胞融合实验使用的小白鼠二、细胞融合技术含义和意义细胞融合技术（Cellfusiontechnology)是指两种不同亲株经酶法除去细胞壁得到两个球状原生质体或原生质体球,然后置于高渗溶液中，在以聚乙二醇（polyethylenegleol)助溶和CaCl2存在下，促使两者互相凝聚集并发生细胞融合，进而导致基因重组，获得新的菌株，这种融合又称为原生质体融合，其融合频率高于常规杂交育种数倍到几十倍。通电前通电3分钟通电10分钟通电2分钟融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解概念：所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合或细胞杂交。意义：细胞融合不受种属的局限，可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒，极大地扩大了遗传物质的重组范围；细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞，因而能够提高基因的转移效率。在技术和仪器设备上的要求不象基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，并可以进行遗传标记，可促进基因重组，对遗传育种，选育优良品质，达到高产优质具有重要意义。此外，细胞工程不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间进行杂交，甚至可以在动物、植物、微生物细胞之间进行融合，形成前所未有的杂交物种。癌是非常令人恐惧的，人们谈癌色变是因为癌细胞能够无限地生长，甚至可以在病人身上长到几十千克。如果不切除，它还会继续长下去，直到癌细胞将正常的组织所需的养分全部掠夺从而把病人折磨至死。但是，当癌细胞离开人体后，这一特性却能够变害为益。现代免疫学早已查明，一种抗体是由一种B淋巴细胞产生的，人体内约有一亿种不同的B淋巴细胞，可产生一亿种不同的抗体。杂交瘤细胞和单克隆抗体的制备只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。杂交瘤技术NielsK.JerneG.KohlerC.Milstein共同获得1984年诺贝尔生理学和医学奖单克隆抗体应用十分广泛，被人们誉为对付癌症的“生物导弹”。如采用抗癌细胞的单克隆抗体与放射性同位素、化学药物或毒素相结合，注入体内同癌细胞结合，能在原位杀死癌细胞，而对其它正常细胞则毫无损伤，因此，单克隆抗体还被喻为“抗癌明星”。单克隆抗体本身也可以起到治疗作用，比如，注射乙肝病毒的单克隆抗体可以达到预防乙肝的目的。二、细胞融合技术意义生物技术发展至今，细胞成了科学家们随意发挥想像力的乐园，甚至可以把生命像积木那样组装起来，进行细胞水平上的生命组合游戏。最具代表的是美国耶鲁大学教授克莱白特等的杰作。在黑毛鼠、白毛鼠、黄毛鼠的受精卵分裂成8个细胞时用特制的吸管把8细胞胚吸出输卵管，然后用一种酶将包裹在各个胚胎上的粘液溶解，再把这三种鼠的8细胞胚放在同一溶液中使之组装成一个具有24个细胞的“组装胚”。再把“组装胚”移植到老鼠的子宫内，不久，一只奇怪的组装鼠问世，鼠全身披着黄、白、黑三种不同颜色的皮毛。迄今为止，英国和美国还组装成功了绵羊和山羊的嵌合体——绵山羊。据说，世界各国科研人员热情高涨，正在组装“五位一体”、“六位一体”的生物。FirstClonedAnimalsbySCNTSheep,1997Mice,1998Calves,1998Goats,1999Pigs,2000Cat,2002Rabbit,2002Mule,2003Horse,2003Rats,2003Dogs,2005Ferrets,2006三、细胞融合的方法和步骤诱导细胞融合的方法有三种：（一）生物方法（病毒）采用病毒促进细胞融合，如仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusionprotein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合。（二）化学方法（聚乙二醇PEG）（三）物理方法（电激和激光）。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程电融合诱导法原理示意图步骤举例：人、鼠细胞融合实验分三步进行∶第一步、首先用荧光染料标记抗体∶将小鼠的抗体与发绿色荧光的荧光素(fluorescin)结合,人的抗体与红色荧光的罗丹明(rhodamine)结合；第二步、将小鼠细胞和人细胞在灭活的仙台病毒诱导下进行融合；第三步、将标记的抗体加入融合的人、鼠细胞中，让标记抗体同融合细胞膜上相应的抗原结合。开始,融合的细胞一半是红色,一半是绿色。在37℃下40分钟后,两种颜色的荧光在融合的杂种细胞表面呈均匀分布，这说明抗原蛋白在膜平面内经扩散运动而重新分布。三、细胞融合的方法和步骤（一）氨基酸生产菌种的育种（二）酶制剂生产菌种的育种（三）酵母菌的育种（四）酱油曲霉菌的育种四、细胞融合技术的应用动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体核移植动物细胞工程其它动物细胞工程的基础第二节动物细胞工程及其应用重点人造皮肤一、动物细胞培养1、概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.2、原理：细胞增殖定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液转入培养瓶内培养（贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。①原代培养原代培养这只老鼠身上的“人耳”是由我国科学家曹谊林教授利用生物技术培养出来的.◆取供体细胞传代培养10代以内的细胞.◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：电刺激◆胚胎移植至代孕受体内妊娠、分娩二、核移植供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。有人说它三个母亲体细胞核移植技术存在的问题在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。在应用上，生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。三、动物细胞工程在食品工业中的应用激素疫苗药用蛋白植物组织培养植物体细胞杂交植物细胞工程的基本技术植物细胞工程的理论基础植物细胞的全能性第三节植物细胞工程及应用当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态。受精卵的全能性最高；其次是生殖细胞（尤其是卵细胞）；体细胞的全能性比生殖细胞低得多。一、植物组织培养离体的植物器官、组织或细胞脱分化（又叫去分化）愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）再分化根或芽等器官植物体植物组织培养的条件：适宜的养料和激素，适宜的温度和无菌条件切取形成层诱导愈伤组织的形成试管苗的形成培养室移栽脱分化再分化无菌接种在植物组培过程中，为什么要进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作？无菌操作技术细胞工程培养中最重要的，也是最基本的要求就是各项操作应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养基、器皿材料、接种工具、操作环境、培养室和超净工作台等各个环节都应注意。瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正确错误防止操作带来的污染，接种过程中尽可能达到悬空要求•正确错误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正确错误接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中正确错误二、植物体细胞杂交将不同种植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的问题自然界中有一种含有叶绿体的原生动物──眼虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活。请探讨：动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗？狮虎兽与虎狮兽生殖隔离.如果动植物细胞理论上可以实现杂交，请设计出具体实验方案。异想天开三、植物细胞工程的应用繁殖植物的新途径–微型育种–作物脱毒–人工种子育种新方法–单倍体育种–诱导突变体细胞产物的工厂化生产没有种子，如何繁殖？三倍体无子西瓜的培育过程优点：繁殖率高，可大批量生产取材少培养周期短保持优良性状不受自然生长季节限制1、微型繁殖繁殖植物的新途径试管苗大规模培养2、作物脱毒长期进行无性繁殖的作物，易积累感染的病毒，导致作物产量降低，品质变差，而分生区附近（茎尖、根尖）一般不会感染病，用分生区的细胞进行组织培养，就能得到大量的脱毒苗。人工种子结构：–人工薄膜+胚状体（不定芽、顶芽、腋芽）优点：–不受气候、季节、地域的限制–保留优良性状–时间短，占地少作物新品种的培育1.单倍体育种(1)方法:花药的离体培养(2)优点:后代稳定遗传,都是纯合体;明显缩短育种年限2.突变体的利用(1)产生:植物组