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第六章食用菌选种育种技术第一节食用菌的繁殖方式第二节食用菌的生活史第三节选种技术第四节育种技术教学目标：掌握常规菌种筛选技术；掌握孢子分离技术；基本掌握诱变育种和细胞质融合育种技术。教学重点：组织分离技术、孢子分离技术食用菌的繁殖方式共有三种，即无性繁殖、有性繁殖和准性繁殖。第一节食用菌的繁殖方式一、无性繁殖不通过有性生殖细胞的结合，而由亲代直接产和新个体的生殖方式叫无性繁殖，食用菌的无性繁殖主要有以下几种形式：1.可以菌丝断裂的方式繁殖：2.以产和无性孢子的方式繁殖：如香菇产生节孢子，双孢蘑菇产生次生孢子，草菇产生厚垣孢子，黑木耳产生钩状分生孢子等。3.以出芽方式繁殖：二、有性繁殖通过有性生殖细胞的结合，产生新个体的繁殖方式，叫有性繁殖。孢子核基因的不同就决定了其所萌发成的单核菌丝的不同性别。有性繁殖根据进行质配的单核菌丝的性别，又可以分为以下两种形式。（一）同宗结合：1.初级同宗结合由单个孢子萌发而形成的菌丝全，无需亲和性，很快发展成双核菌比体，并通过锁状联合增殖。每个细胞内的两个核没有遗传上的差别，均能形成子实体。2.次级同宗结合减数分裂后4个子核，“雌雄”两两相配分别通过孢子梗（小梗）进入孢子，形成2个含有异核的孢子。这种担孢子一旦萌发，初期为多核，随之产生隔膜，将每一个细胞分隔成只含有2个核的细胞。顶端细胞核又不断再进行分裂，到一定程度又再被横隔成每一细胞内只含有2个核的菌丝，周而复始。这种双核菌丝具有结实性，称之为次级同宗结合。（二）异宗结合异宗结合是一种“雌雄不同株”自身不孕的有性生殖方式。在担子菌亚门中，异宗结合占90%，主要有两种形式。1.二极性异宗结合一部分食用菌的单核菌丝有“雌”、“雄”之分，通常用“＋”、“－”表示。唯有两条性别不同的菌丝进行交配产生的双核菌丝，才具有结实性。2.四极性异宗结合由同一子实体所产生的担孢子萌发的菌丝间进行交配时，唯有1/4的交配组合能产生可孕的双核菌丝。第二节食用菌的生活史食用菌的生活史，是指从孢子萌发，经历菌丝体、子实体阶段，直到产生第二代即同一种孢子的全过程。一、伞菌的生活史1.担孢子萌发2.单核菌丝（初生菌丝）开始发育。3.两条可亲和的单核菌丝进行质配。4.质配形成异核的双核菌丝。多数种类的双核菌丝可见锁状联合，一、伞菌的生活史5.在适宜的环境条件下，双核菌丝体组织化，开成各种食用菌所特有的子实体。6.来自两个亲本的一对交配型不同的单倍体核在担子中融合，进行核配，形成一个双倍体核。7.双倍体核进行减数分裂，结果产生四个单倍体核，原担子变成担子。8.各个单倍体核分别移支担子小梗的顶端，形成担孢子。至此，一个完整的生活史结束了。二、有性生殖过程中细胞核的变化一是质配后开始的异核双核阶段，即异核双核期。具有产生子实体的能力。二是核配后开始的短暂的双倍核期。三是核配马上进行减数分裂，每个细胞中都有4个单倍体核，称为单核期，此期亦短暂。第三节选种技术一、选种的原理和方法1.原理食用菌的种性是通过菌丝体的繁衍逐代传递的，所以自然选择就侧重于在不同菌株之间进行，而不是在同一菌株的后代中进行。食用菌自然选育的基本流程：收集品种资源生理性能测定品种比较试验扩大、示范推广2.方法①品种资源的收集.尽可能的收集有足够代表性的野生菌株。确定采种的目标，采集点的地理条件，并做好详细的采集记录。②生理性能测定标本采集后应尽快采用多种分离方法获取菌株，随后，立即用平板做拮抗试验（即分离的菌株菌丝两两配对接入同一平板培养基内），适温培养，经十余日，不同菌株的菌落内是否出现拮抗线，同时还可在平板或生长测定管上测定菌丝生长速度及对温度的反应。③菌株比较比较各菌株的优劣，详细记录各菌株的产量、菇形、温性、干鲜比、始菇期、菇潮间隔、形态等。为了试验的准确性，要保证菌种的质量，培养基配方，接种，管理措施等可能影响结果的因素，尽可能使之一致。试验还应按生物统计原理进行安排。④扩大试验上述的品种评比结果仅是个阶段性的成果，还应和当地的当家菌株同时进行栽培，证实它是更优良的菌株。⑤示范推广经扩大试验后，将选出的优良品种放到有代表性的试验点进行示范性生产，待试验结果进一步确定之后，再由点到面推广。二、菌种分离什么是菌种的分离呢？将有价值的子实体的局部组织、孢子或基内菌丝移接到斜面试管培养基上，获得纯培养菌丝的操作称为菌种分离。（一）种子资源的获得种子资源的获得有野外采集和栽培场所采集两种途径。野外标本的采集，主要适用于食用菌的野生种驯化、遗传育种、生理生态以及各种研究用的一级种的分离。而在食用菌栽培上的一级种的分离，其种菇的来源主要是从栽培场中经留种获得的。①种菇（耳）的选择分离对象应从当地当家品种，或从外地引进并经大面积栽培后表现出高产、稳产的菌株中选择。留种种菇要求菇形理想，长势健壮，无虫无病的子实体。②成熟度的选择组织分离一般选择幼菇，即器官分化尚未结束时采摘。此时菇体正在生长。从最旺盛的“生长点”挑取组织，其菌丝萌发快，长势好，而且操作时，组织块纤维化程度低，容易挑取。（二）菌种分离菌种分离可以分为孢子分离、组织分离和基内菌丝分离三种。1.分离前的准备①培养基的选择通常使用PDA培养基。特殊分离培养时，常采用相应的培养基。②种菇的预处理种菇采摘后，若种菇水分太高，菇盖沾粘，可适当风干后再进行分离。胶质耳只能用无菌水多次冲洗，无菌滤纸吸干，然后让耳片子实层上重新产生成熟的孢子供分离，这样可降低污染率。2、组织分离①伞菌组织分离法组织分离时，用75%酒精棉球擦拭双手及接种工具。点燃酒精灯，将尖头镊子烧灼灭菌；随后将种菇纵向撕成两半，于菌柄、菌肉交界处切取火柴头大小的组织块，迅速抖落到试管中，烧灼管口及棉塞，塞上棉塞。这些操作都是在酒精灯火焰无菌区域进行的。②胶质菌类组织分离法一种方法是将耳片反复用无菌水冲洗，切成0.5cm小块移入培养基，于28℃下进行培养；另一种方法是剖取尚未展开耳片的耳基团内的组织块进行分离。③菌核的组织分离法一些药用菌如茯苓、猪苓、雷丸都有菌核。进行组织分离时，采用含浆汁多的菌核。在无菌的条件之下，将菌核剖开，于菌核的附近，剖取蚕豆大小的菌核组织块移入斜面培养基上，在26-30℃下培养。④特特殊的组织分离2.菌索分离3.子实层分离1.生长点分离3.木腐菌基内菌丝分离①把分离用菇木的部分或全部的表面在火焰上轻燎。②取小刀在火焰上灭菌，对准菇木上菇柄（耳基）的着生位置切成两半。③确定欲分离菌丝在菇木上的位置，再次用火焰灭菌过的小刀，在欲分离部位刻划数个井字。④用火焰灭过菌的接种钩，钩取一小块木屑（绿豆大小或更小）移接于斜面培养基。⑤接种后将试管置于25—27℃下培养，促使其恢复。近风干的种木内菌丝常处于休眠状态。接种后，种木吸湿，菌丝逐渐恢复生长。如果短期时间内分离物未曾发，则可保留至4周后，再断定分离是否成功。孢子分离主要是指利用子实体上产生的成熟有性孢子分离培养获得纯菌种的方法。分为多孢分离与单孢分离两种。（一）多孢分离4.孢子分离技术1.种菇孢子弹射法2.帖褶法3.褶上涂抹法：4.空中孢子捕捉法:5.钩悬法6.试管插割法此法方便快捷，成功率高，是多数菌种孢子分离的主要方法。适合于大型子实体的孢子分离。具体操作方法是：无菌操作迅速用无菌试管取下组织块。用接种镐将组织块推至距斜面培养基1cm处，塞好棉塞。于25-28℃条件下见光竖立培养至12小时左右，在无菌操作条件下用尖头镊子取出组织块。继续暗光培养，2-3天后，萌发成星芒状的单孢子菌落。所谓单孢分离即从收集到的多孢子中将单个孢子分离出来，分别培养，作为育种的材料。1.涂抹法：用已沾湿无菌水的接种针，从孢子印上沾取孢子，在无菌条件下，插入盛用无菌水的小试管内振荡稀释成适宜浓度的孢子悬浊液。随后无菌条件下划线培养。（二）单孢分离2.梯度稀释点样法用同样的方法制成浓度较高的孢子悬浊液。同时取灭菌过的空试管数根，排序编号。按无菌操作规程获得一系列的不同浓度梯度的孢子悬浮液。再用毛细管在各个梯度孢子液中取样培养，单孢萌发后菌丝便长入小培养基块中，再将其转移到试管斜面上培养获得单孢培养物。第四节育种技术一、杂交育种的原理食、药用菌的杂交是指不同种或种内不同株系之间的交配，后者则理重要。二、杂交育种的方法1.选择亲本：2.单孢子分离3.单孢子杂交配对4.转管繁殖将可亲和的组合移入新的斜面保存备用。四极性的异宗结合的食用菌，由于自交不育，经配对后，凡出现双核菌丝的组合，并能正常结实者，即证明杂交成功。次级同宗结合食用菌（如双孢蘑菇），首先经过单孢子分离、培养，获取不孕菌丝。随后进行不孕性菌丝间的配对。5.初次筛选经过初步筛选，淘汰大部分表现一般的菌株。经初筛后再做出菇试验比较，选出优良菌株。6.复筛通过栽培比较，选出少数性能优良的菌株。出菇鉴定包括如下几个方面：①菌丝生长速度：②出菇菌块（袋）的表型特征：③子实体表型特征：④测定其最适生长温度、湿度等。⑤计算子实体的产量。7.小面积栽培试验：将复筛菌株置于不同地域的栽培区进行栽培，以考察其适应性与性状的稳定性，并做相关的详细记录。8.大面各示范推广：逐步扩大栽培面积，进行示范性的推广，将种性优良、优质高产的菌株逐渐定为当家菌株。9.为确定保留下来的杂交新品种正式定名，并申请有关部门批准。细胞工程重点研究和开发的是细胞融合技术和细胞培养技术。细胞融合技术是人们按照需要，使两个不同遗传特性的细胞，融合成一个新的杂种细胞，从而人工构建新型细胞，这个细胞兼有两个亲代细胞的遗传特性。细胞工程在食用菌育种中的应用